[发明专利]用于鉴定双孢蘑菇非杂交菌株特性的RAPD引物与方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及用于鉴定双孢蘑菇非杂交菌株特性的RAPD引物与方法。

背景技术

双孢蘑菇是世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，具有重要的经济价值，2014年的世界总产量达400多万吨，约占世界食用菌总产量的四分之一。我国是世界上最大的双孢蘑菇科研、生产、加工与出口的国家，2014年全国产双孢蘑菇鲜品达200多万吨，占世界年产量的一半，产值超百亿元人民币，因此双孢蘑菇生产具有显著的经济效益、社会效益和生态效益。

我国1925年前后从国外引进双孢蘑菇到国内栽培,1978年开始品种的改良。1989年本单位利用引进种质在国内首先育成双孢蘑菇杂交菌株As2796并成为我国唯一的当家品种，目前已是世界上年产鲜菇量最大的双孢蘑菇商业菌株。但是，As2796从育种至今已使用二十年，面临着商业菌株不可避免的退化问题，而日渐细化发展的蘑菇产业也需要各类专用的优良新菌株。比如，高产型菌株适于工厂化生产，优质型蘑菇适于罐头加工和鲜销，等等。引入未经杂交的传统或野生种质进行种质创新，进而通过分子标记辅助杂交育种等手段获得各种优良专用双孢蘑菇新菌株是解决此问题的重要途径之一。

福建省农业科学院食用菌研究所（本发明人单位）多年来坚持收集世界各地的双孢蘑菇种质资源，至今已保藏双孢蘑菇菌株400多株，大部分为未经杂交的传统或野生菌株，其中不乏高产菌株和优质菌株，如何快速评价和利用这些传统或野生种质成为新品种选育的关键。这些传统或野生菌株一般具有高产菌株不优质，而优质菌株不高产的特点，在杂交育种中需要选择不同类型的亲本，传统的筛选手段盲目性强，需要进行出菇来筛选，工作量巨大。

近年来发展的DNA分子标记辅助育种技术是食用菌定向辅助育种的一个重要方向。RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增的多态性DNA)技术在生命科学的许多研究领域已得到广泛的应用，包括遗传多态性研究、分类研究、遗传关系分析、某些特定基因标记、作连锁图谱等。这种以PCR反应为基础的技术克服了同工酶和RFLP等技术的一些缺点，具有快速、安全、简便、灵敏度高、需样量少的特点。我们通过大量的RAPD引物筛选和验证，找到了一种适用于双孢蘑菇非杂交菌株优质或高产性状预测的、操作快速准确的分子标记。该标记与双孢蘑菇菌株优质性状紧密连锁，利用该分子标记能在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定用作亲本的传统或野生菌株的优质或高产性状，不用出菇试验，省时省力，这对杂交育种中缩短育种周期、提高育种效率有着重要的意义。

发明内容

本发明基于分子标记技术，建立一种双孢蘑菇非杂交菌株特性鉴定的RAPD标记与方法。

本发明为一种双孢蘑菇非杂交菌株特性鉴定的RAPD标记与方法，是利用RAPD分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增。

利用RAPD引物对双孢蘑菇菌株基因组DNA进行RAPD-PCR，能特异性地扩增出1900bp的产物，所述RAPD引物的核苷酸序列为：5’-GAGGTCCACA-3’。

所述的RAPD-PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸1min，扩增42个循环；72℃延伸5min,4℃保存。反应体系为：30ng模板DNA，30ng引物，0.1mmol/LdNTPs，2.5mmol/LMgCl₂，1UTaqDNA聚合酶，1×PCR缓冲液，用ddH₂O将总体积补至20μL。

本发明的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇非杂交菌株的优质或高产特性，该方法耗时短，操作简便，特异性强，无需出菇，省时省力。根据特异性扩增产物1900bp条带的有无来鉴定菌株的优质或高产性状，具有该条带的菌株为优质菌株，没有该条带的菌株为高产菌株。

附图说明

图148个双孢蘑菇非杂交菌株的RAPD-PCR扩增产物图谱，M:LambdaDNA/EcoRI+HindIII分子量标记；1-24：24个优质菌株，25-48：24个高产菌株，详见表1。箭头指示1900bp特异条带的位置，优质菌株均扩增出该条带，高产菌株均未扩增出该条带。

具体实施方式：

实施例1：

1.TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs购自厦门泰京生物有限公司，RAPD引物购自上海生工生物科技有限公司。所述RAPD引物的核苷酸序列为：5’-GAGGTCCACA-3’。