[发明专利]一种特异性sgRNA分子及其应用

权利要求书

1.一种sgRNA分子，其特征在于，所述sgRNA分子包括一段固定序列片段和一段目的DNA识别片段，所述目的DNA识别片段可与目的DNA形成碱基互补配对，所述sgRNA分子种子区域的GC含量不高于30％；优选为GC含量不高于20％，更优选为GC含量不高于10％。

2.权利要求1所述的sgRNA分子，其特征在于，所述固定序列为蛋白分子结合片段，蛋白分子优选为核酸酶。

3.一种编码权利要求1所述sgRNA分子的DNA片段。

4.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有权利要求3所述DNA片段。

5.权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒载体或病毒载体。

6.权利要求4所述的表达载体，其特征在于，U6启动子、权利要求3所述的DNA片段、以及TTTTTT终止序列顺序连接。

7.一种目的基因的特异性识别方法，其特征在于，利用权利要求1所述的sgRNA分子中的目的DNA识别片段特异性地与目的基因片段结合，而不与目的基因片段的同源序列片段结合。

8.一种目的基因的特异性切割方法，其特征在于，利用权利要求1所述的sgRNA分子中的目的DNA识别片段特异性识别并结合目的基因片段，而不与目的基因片段的同源序列片段结合；sgRNA分子中固定序列片段可与一种核酸酶结合并通过识别靶位点处的PAM序列，引导核酸酶到结合的目的基因片段处，剪切目的基因片段。

9.一种目的基因的特异性敲除方法，其特征在于，利用权利要求1所述的sgRNA分子中的目的DNA识别片段特异性识别并结合目的基因片段，而不与目的基因片段的同源序列片段结合；sgRNA分子中固定序列片段可与一种核酸酶结合并通过识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因片段处，剪切目的基因片段，随后从切口处脱落，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。

10.一种目标位点特异性的基因敲入方法，其特征在于，利用权利要求1所述的sgRNA分子中的目的DNA识别片段特异性地识别并结合目标位点处的目的DNA片段，而不与目的基因片段的同源序列片段结合；sgRNA分子中固定序列片段可与一种核酸酶结合并通过识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因片段处，剪切目的基因片段，在目的DNA片段处形成DSB缺口；随后细胞利用同源重组和DNA修复机制，将外源DNA片段插入到切口处，实现外源基因的定点敲入。