[发明专利]一种特异性sgRNA分子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因修饰技术领域，具体涉及一种特异性sgRNA分子及其应用。

背景技术

基因编辑技术，是近年来发展起来的一项基因组修饰技术，可在基因组特定位点进行InDel突变、敲入、多位点突变、小片段删除、以及片段替换等操作。在科学研究领域，基因编辑技术可用于模式生物的快速构建；在农业领域，该技术可用于植物品种改造；而在健康医疗领域，该技术还有可能通过改造人类自身基因，达到治疗疾病的目的。因此，基因编辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。

目前，基因编辑技术主要有锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复技术(CRISPR/Cas9)。技术原理上，三种主流的基因编辑技术都是通过特异序列的靶向识别和切割，造成基因组DNA断裂，在细胞的非同源末端连接修复(non-homologousendjoining，NHEJ)和同源重组修复(HR)过程中，实现基因组序列的编辑。

作为第一代基因编辑技术，锌指核酸酶首次实现了基因的靶向操作，并得到了广泛的应用。锌指核酸酶的DNA识别域是由一系列锌指蛋白模块串联组成，每个锌指蛋白模块识别并结合DNA链上一个特异的三联体碱基，将目的基因对应的一系列锌指蛋白模块串联在一起，即可实现对目标序列的特异性识别。锌指核酸酶是一个异源二聚体，其中每个亚基含有一个锌指结构域和一个Fokl核酸内切酶结构域。Fokl结构域必须二聚化才有活性，可确保必须同时存在两个相邻的DNA结合位点时才能引发DNA双链的断裂，从而增加了目标特异性。尽管文献报道的锌指核酸酶的基因打靶效率能达到30％，并可以针对某些特定的DNA序列设计相应的锌指核酸酶，实现基因组序列的定位修饰，但其发展也存在较大的局限性。一方面，锌指核酸酶的识别结构域中存在上下文序列依赖性，增加了设计、筛选难度；另一方面，锌指核酸酶的脱靶切割会导致细胞毒性，制约了其在基因治疗领域的应用。

作为第二代主流基因编辑技术，TALEN在技术上比锌指核酸酶更加简便，使用上更加灵活。TALEN是二聚化的转录因子/核酸酶，其核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸，双连氨基酸序列与A、G、C、T的识别具有稳定的对应关系。通过组装这些模块，研究人员可靶定任何目标序列。

CRISPR/Cas技术是新近发展起来的第三代基因编辑技术。与锌指核酸酶技术和TALEN技术不同，CRISPR/Cas技术源于天然存在的原核生物适应性免疫系统。2012年8月，美国加州大学伯克利分校和德国汉诺威医学院的研究人员在《Science》杂志上发表文章，报道了该系统的工作原理，并提示可通过更换向导RNA序列来对该系统进行重新编程。

对CRISPR/Cas系统的研究发现，CRISPR/Cas系统是通过RNA介导的DNA内切酶进行基因组编辑操作，它们分别就是CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA(trans-actingCRISPRRNA，tracrRNA)。这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA(single-guideRNA，sgRNA)。sgRNA包括一段20bp左右的DNA识别区与一段固定序列，其DNA识别区与靶位点处碱基互补，引导Cas9蛋白在结合区随机剪切DNA双链，形成DSB(DoubleStrandedBreaks)缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制(NHEJ)修复目的基因双链。在修复的过程中易形成移码突变，导致靶位点处基因失去功能。若同时转入基因修饰过的目的基因片段，可靶向定点敲除、插入、突变、修复相应碱基位点。sgRNA切割作用的一个重要特征是sgRNA靶位点的下游临近区域需要存在一个三碱基的PAM序列，通常为NGG。

CRISPR/Cas技术介导的基因组编辑是由crRNA指导的，通过与DNA序列的碱基配对，实现目标位点的识别。在技术原理上，比锌指核酸酶和TALEN技术(利用蛋白质功能区识别DNA序列)要精确得多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。在实际操作中，CRISPR/Cas9的构建仅仅需要设计与靶序列互补的RNA即可，过程更为简单，大大提高了基因编辑的操作效率。但对于所有基因编辑技术而言，高效性和特异性是技术成功的两个重要方面，CRISPR/Cas技术野不例外。尤其是在人类疾病的基因治疗中，特异性的重要性更显突出。