[发明专利]三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变的检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：

10×PCR反应缓冲液1.0ul；

25mMMgCl₂溶液0.5ul；

2.5mMdNTPMixture1.0ul；

5U/ulTaqDNA聚合酶0.25ul；

10uM引物F0.25ul；

10uM引物R0.25ul；

10×内切酶反应缓冲液2μl；

10U/μlNcoI内切酶0.5μl；

灭菌蒸馏水13.5ul；

所述引物F的碱基序列如SEQ:ID:NO:1所示；

所述引物R的碱基序列如SEQ:ID:NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变的检测试剂盒，其特征在于，具体检测步骤如下：

1）取三阴性乳腺癌患者外周血基因组DNA；

2）PCR反应：

反应体系总体积为10ul，包括10×PCR反应缓冲液1.0ul，25mMMgCl₂溶液0.5ul，2.5mMdNTPMixture1.0ul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.25ul，10uM特异性引物对F和R各0.25ul，灭菌蒸馏水6.0ul，DNA1.0ul；反应条件为95℃5分钟，此后进行35个循环的98℃10秒、55℃30秒、72℃30秒，最后一步为72℃5分钟；

3）限制性内切酶酶切

取步骤2）所得产物加入试剂盒中所包含10×内切酶反应缓冲液2μl，10U/μlNcoI内切酶0.5μl，去离子水7.5μl，在37℃条件下水浴1小时；

4）3％琼脂糖凝胶电泳检测上述所得酶切产物，根据电泳条带大小判断是否存在TNF-α308G>A遗传变异，判断方法如下：

（1）若rs1800629位点上两个等位基因均存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见仅171bp处存在条带；

（2）若rs1800629位点上仅一个等位基因存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见171bp、131bp处均存在条带；

（3）若rs1800629位点上并未存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析仅在131bp处可见条带。