[发明专利]三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因诊断学领域，为检测与三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变的试剂盒，通过检测TNF-α基因启动子区308G>A遗传变异（rs1800629）预测三阴性乳腺癌的转移风险。

背景技术

三阴性乳腺癌（triple-negativebreastcancer，TNBC）作为一种特殊亚型，特指雌激素受体（estrogenreceptor，ER）、孕激素受体（progestronereceptor，PR）、表皮生长因子受体2（humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2）均为阴性的乳腺癌，约占全部乳腺癌的15%，好发于年轻妇女，大约1/3的患者术后2-3年内发生复发和转移，并且在复发后快速进展直至死亡。在TNBC患者中及早评估其转移风险，筛选出转移风险高的患者并对该人群进行密切检测及早期干预治疗将有助于临床上改善TNBC患者预后。尽管三阴性乳腺癌转移风险高且预后较差，目前并未存在能够评估TNBC患者转移风险的分子生物学及基因诊断方法。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种快速有效的检测TNF-α基因启动子区308G>A遗传变异从而检测三阴性乳腺癌的试剂盒，同时提供了其具体检测方法。

本发明试剂盒中的各组分及含量如下：

10×PCR反应缓冲液1.0ul；

25mMMgCl₂溶液0.5ul；

2.5mMdNTPMixture1.0ul；

5U/ulTaqDNA聚合酶0.25ul；

10uM引物F0.25ul；

10uM引物R0.25ul；

10×内切酶反应缓冲液2μl；

10U/μlNcoI内切酶0.5μl。

灭菌蒸馏水13.5ul；

所述引物F的序列如下：5’-CCCCAAAAGAAATGGAGGCAATAGGTTTTGAGGGCCATG-3’（SEQ:ID:NO:1）；

所述引物R的序列如下：5’-GTTGGGGACACACAAGCATC-3’(SEQ:ID:NO:2)；

本试剂盒为一人次检测用量，保存温度-20℃。

具体检测步骤如下：

1）取三阴性乳腺癌患者外周血基因组DNA；

2）PCR反应：

反应体系总体积为10ul，包括10×PCR反应缓冲液1.0ul，25mMMgCl₂溶液0.5ul，dNTPMixture(2.5mM)1.0ul，TaqDNA聚合酶0.25ul（5U/ul），特异性引物对F和R（10uM）各0.25ul，灭菌蒸馏水6.0ul，DNA1.0ul；反应条件为95℃5分钟，此后进行35个循环的98℃10秒、55℃30秒、72℃30秒，最后一步为72℃5分钟；

3）限制性内切酶酶切

在步骤2）所得产物加入试剂盒中所包含10×内切酶反应缓冲液2μl，NcoI内切酶0.5μl(10U/μl)，去离子水7.5μl，在37℃条件下水浴1小时；

4）3％琼脂糖凝胶电泳检测上述所得酶切产物，根据电泳条带大小判断是否存在TNF-α308G>A遗传变异，判断方法如下：

（1）若rs1800629位点上两个等位基因均存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见仅171bp处存在条带；

（2）若rs1800629位点上仅一个等位基因存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见171bp、131bp处均存在条带；

（3）若rs1800629位点上并未存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析仅在131bp处可见条带。

携带A等位基因的三阴性乳腺癌患者发生肿瘤远处转移的风险高（OR=5.83,95%CI:1.64–20.76,P=0.004）。

TNF-α基因启动子区域的rs1800629号SNP位点的多态性与女性三阴性乳腺癌的远处转移相关，因此，可用于评估三阴性乳腺癌的转移风险。当三阴性乳腺癌患者DNA的TNF-α基因启动子区域的rs1800629号SNP位点基因型为AA或AG时，个体的肿瘤转移风险较高。