[发明专利]猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒抗原制备技术领域，具体涉及猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)首次发现于1974年，Tischer等人从污染的猪肾细胞系PK-15(ATTC-CCL33)中分离到一种类似圆环病毒的新病毒，定名为猪圆环病毒(PCV)。血清学调查表明，猪圆环病毒抗体在猪群中长期存在，但没有相关证据表明何种疾病是该病毒感染引发的。因此，在当时人们认为该病毒是非致病性的。一年之后，北美和欧洲在断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)患病猪身上提取的组织中分离出类似猪圆环病毒的病原体。人们将最初无致病性的猪圆环病毒和与PMWS爆发有关的新发现的分离病毒进行比较，发现这两个病原体在基因结构和抗原性上均有不同。因此，猪圆环病毒被分为两个亚型：从PK-15细胞系中分离出的无致病性的病毒被命名为猪圆环病毒1型(PCV1)；从患病猪身上分离出的猪圆环病毒被命名为猪圆环病毒2型(PCV2)。目前，流行病学调查显示，PCV2已经在世界范围内广泛分布，规模化养殖场几乎没有血清阴性的猪。自PMWS首次在加拿大爆发至今，全世界五大洲均诊断出PMWS的感染，对大多数养猪国造成了极大的威胁。

PCV2是目前已知的最小的病毒之一，其基因组是一条共价闭合的单链DNA，近似于1.76kb～1.77kb。一般认为PCV2有11个开放阅读框(openreadingframes，ORFs)，然而仅有三个开放阅读框被认为可以编码蛋白。其中ORF2又称为CAP基因，位于互补链上，呈逆时针方向，负责编码唯一的结构蛋白CAP，其氨基酸长度为233aa～234aa。CAP蛋白也是PCV2的主要抗原，能诱导中和抗体的产生。

由于防治PCV2的重要性，有关PCV2疫苗的制备成为生物制品研发的热点之一。现有技术的PCV2疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，但由于PCV2在体外细胞中培养难度大，增殖力弱，导致现有技术的PCV2疫苗存在滴度较低，成本较高的缺陷。另一方面，PCV2亚单位基因工程疫苗则有效克服了灭活疫苗和减毒活疫苗的上述缺陷，它是通过原核或真核表达系统表达PCV2的结构蛋白CAP，再以此来制备PCV2的病毒样颗粒(Viruslikeparticles,VLP)，该VLP不含有病毒核酸，却具有与病毒相似的衣壳结构，能够作为抗原诱导机体免疫应答，进而产生抗体。然而，现有技术中PCV2的CAP蛋白表达效率较低，这一方面是由于表达系统本身不适于CAP蛋白表达基因的表达，另一方面也反应出CAP蛋白表达基因与现有技术的表达系统不能较好的契合，这严重影响了抗原的产量及后续疫苗的制备。

那么如何针对CAP蛋白表达基因自身特点获取一套适宜的表达系统和配套的工艺方法，同时实现CAP蛋白表达基因与表达系统的高效契合，将成为提升抗原制备效率的关键。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，以解决现有技术中猪圆环病毒2型CAP抗原表达水平较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术的猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法操作繁琐的技术问题。

本发明要解决的再一技术问题是由于现有技术的猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，所制备的CAP蛋白难以形成病毒样颗粒，因此免疫原性较差的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，该方法是将猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因整合到质粒上得到重组质粒，而后将所述重组质粒利用杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型CAP蛋白。

优选的，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因是在猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因基础上，以杆状病毒偏嗜密码子替换其中的杆状病毒非偏嗜密码子所修饰后的基因；在此基础上进一步优选的，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。在该优选技术方案中，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因，是指自然条件下野生型猪圆环病毒2型的CAP蛋白表达基因；所述的修饰，是指对基因的改造，这种改造行为应当保证改造前和改造后所表达的蛋白氨基酸序列不变。

优选的，所述杆状病毒表达系统是flashBAC杆状病毒表达系统。在该优选技术方案中，所述flashBAC杆状病毒表达系统专指由英国OxfordExpressionTechnologies公司(OET公司)出品的型号为“flashBAC”的杆状病毒表达系统。