[发明专利]人NEFL基因rs1059111位点多态性检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及测定单核苷酸多态性的方法。

背景技术

SNP(单核苷酸多态性)是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基的置换、插入和缺失等形式。基因多态性是个体与生俱来的遗传特征，不随环境发生变化，也不是某种疾病特异或者非特异的临床表现，因此其应用并不存在诊断和治疗作用。

基因多态性检测在遗传学领域和医学领域中应用广泛，举例如下：1.研究物种起源和进化等遗传学现象。根据基因变异情况，获得生物大分子的信息，推断生物进化历史，阐明物种进化关系。应用于考古学中以确定古人类遗传变异特征以及不同种群的亲缘关系。2.研究多态与种群亲缘关系等遗传学研究。多态亦与各种人体特征密切相关，包括身高、体重、肤色、相貌特征等等。3.在预防医学领域可以用于疾病预防措施。通过研究人体对毒物的耐受性，发现易于对某种毒物发生毒性作用的个体，及时避免该个体与毒物接触，保护该易感人群。例如，对准备从事接触苯等有机溶剂的人群进行多态检测，筛查出容易出现血液毒性、神经毒性等反应的个体，令其远离苯等有机溶剂，保护此类易感人群免受毒物侵害。4.药理学中可以用于药物选择以及剂量确定。通过多态检测可以判断患病个体对某种药物毒副作用敏感，从而避免使用此种药物以免除其毒性作用。通过判断个体对药物效果的反应程度确定药物剂量，减少药物用量及其副作用。

神经纤维丝(Neurofilaments,NFS)是真核生物细胞中主要的细胞骨架元素，主要存在于神经元中。其按分子量不同可分为三种亚单元，即分子量为68kd的低分子量神经纤维丝(Neurofilment,lightpolypeptide,NEFL),150kd大小的中等大小分子量神经纤维丝(Neurofilament,mediumpolypeptide,NEFM),和200kd的高分子量神经丝(Neurofilament,heavypolypeptid,NEFH)。每种亚单元都是单个基因产物，在细胞骨架中起到重要的作用。低分子量神经纤维丝基因又称为神经纤维丝轻链基因，是近年来研究较多的一种细胞骨架基因，定位于染色体8p21，有4个外显子。有研究表明NEFL基因多态性可能与其编码的蛋白功能有关。NEFL基因rs1059111位点位于UTR-3区域，有研究表明该多态可能影响NEFL的功能。

NEFL基因rs1059111位点多态，在人群中存在两种等位基因A和T，形成三种NEFL基因的基因型：AA型(人体基因组rs1059111多态位点的两个等位基因碱基均为A)，AT型(人体基因组rs1059111多态位点的两个等位基因碱基分别为A和T)和TT型(人体基因组rs1059111多态位点的两个等位基因碱基均为T)。

聚合酶链式反应-限制性片断长度多态(PCR—RFLP)技术是一种快速、简便、准确、低成本测定SNP(单核苷酸多态性)基因型的经典方法。该方法通过引物来对模板进行扩增反应，形成足够数量和稳定的扩增产物，通过对扩增产物的酶切和检测酶切产物的片段长度，最终测定出SNP。NEFL基因rs1059111多态位点采取PCR—RFLP技术进行检测，所需内切酶为Hpy166II，所需内切酶较为单一且价格较贵，因此需要开发新的检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种非疾病诊断或治疗目的用的测定人NEFL基因rs1059111位点多态性的可靠手段。

根据本发明的第一方面，提供了一种测定人NEFL基因rs1059111位点多态性的方法，包括：

提供待测人基因组DNA；

提供扩增人NEFL基因rs1059111位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物具有错配碱基C；

以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含GWCGAC片段或WCGA片段的扩增产物，其中W为人NEFL基因rs1059111位点上的待定碱基A或T；

提供限制性内切酶；

利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切(反应)以获得相应的酶切产物；以及

根据所得酶切产物来确定人NEFL基因rs1059111位点上的待定碱基W是A还是T，其中，限制性内切酶为仅能够切开GTCGAC片段与GACGAC片段之一的限制性内切酶，或为仅能够切开TCGA或ACGA片段之一的限制性内切酶。