[发明专利]人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及乙酰苯丙氨酸的检测技术领域，尤其涉及一种利用表面增强激光拉曼光谱检测乙酰苯丙氨酸的方法。

背景技术

乙酰苯丙氨酸在人体内肝细胞中经过羟化酶的作用，代谢为酪氨酸，在酶的作用下进一步分解为尿黑酸，尿黑酸经过酶的作用转化为乙酰乙酸，最后经过酶的水解作用，最终代谢产物为二氧化碳和水。肝细胞发生病变后，会影响乙酰苯丙氨酸的代谢过程，因此，通过研究人体血清中乙酰苯丙氨酸的含量变化，有助于研究肝细胞病变过程，例如，通过研究肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸的含量变化，可以了解肝癌细胞的生长和破坏机理等。

目前乙酰苯丙氨酸的分析技术主要有色谱、质谱、核磁共振及液质联用和气质联用技术等，它们都有各自的优势与适用范围。但这些设备昂贵、操作复杂、分析周期长，无法满足大批量样品快速检测的需求，也难以进行普及。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法, 具有准确、快速、无损、低成本的特点，能够满足大批量样品快速检测的需求，易于普及，尤其适用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，包括如下步骤：

S1、样品前处理：

按体积比量取血清样品0.15～0.25 份,体积为m，溶于0.45～0.75 份的提取试剂中，混匀定容，体积为V，控温0℃～-4℃，经离心机离心沉底，分层；分离得到上清液，于-18℃～-25℃条件下冷冻一段时间，再取出控温0℃～-4℃，用离心机再次离心沉底，分层；将再次分离所得上清液过0.22μm～0.45μm的有机系滤膜，所得滤液即为样品待测液；

所述提取试剂的制备方法为：按体积比量取甲醇2.5～3.5份、乙腈1.5～2.5份和N,N-二甲基甲酰胺0.5～1.5份，混合置于容器内，-18℃ ～ -25℃密闭保存，用时摇匀；

S2、表面增强激光拉曼光谱检测：

样品待测液中依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，再用激光拉曼光谱仪扫描，根据1002cm^-1±3cm^-1对应峰的强度，从标准曲线上查出对应的乙酰苯丙氨酸含量为c（mg/L），将所述m、V、c按式计算，

得到X（mg/L）,即为血清样品中乙酰苯丙氨酸的含量。

进一步地，所述步骤S1中，血清样品与提取试剂采用涡旋混匀，-18℃～-25℃条件下冷冻10分钟，离心机10000 转/分钟，每次离心3分钟。

进一步地，所述步骤S1中，所述有机系滤膜为尼龙滤膜。

进一步地，所述提取试剂的制备方法中，混合后液体于-18℃ ～ -25℃保存24小时。

进一步地，所述步骤S2中，表面增强试剂为金纳米溶胶，无机盐凝聚剂为氯化钠溶液。

进一步地，按体积比，0.1 份待测液中依次加入0.3 份金纳米溶胶、0.1 份氯化钠溶液。

所述步骤S2中，标准曲线的绘制方法为：

A、乙酰苯丙氨酸标准溶液配制：准确称取乙酰苯丙氨酸标准品10 mg于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液，根据血清样品中的浓度范围进行适当稀释，制成不同浓度的系列标准溶液；

B、将制得的系列标准溶液中依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，加入量与样品待测液的加入量相同，再分别用激光拉曼光谱仪扫描，记录1002cm^-1±3cm^-1对应峰的强度，将标准溶液的浓度与其对应峰强度制成标准曲线。

本发明上述人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，尤其适用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定。肝细胞肝癌( HCC) 是最常见的腹内恶性肿瘤之一，占原发性肝癌( PHC) 的91.5%，在世界范围内其发病率和死亡率分别居恶性肿瘤的第5位和第3位，同时它的5年生存率还不到7%。目前我国肝癌的发病人数占全球的55%，其死亡率排在恶性肿瘤的第2位，是严重威胁我国人民生命健康的疾病。通过研究肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸的含量变化，对了解肝癌细胞的生长和破坏机理具有十分重要的意义，为肝癌细胞的研究提供了一条新的途径。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

1）本发明提取试剂可高选择性沉淀大分子蛋白，降低杂质干扰，保留病变肝细胞代谢标志物乙酰苯丙氨酸，有效提高目标物提取率，提高检测的灵敏度。