[发明专利]一种抗菌肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗菌肽的制备方法。

背景技术

目前，随着传统抗生素的滥用，细菌耐药性问题和药物残留问题已日趋严重，甚至出现超级细菌，而这些问题也直接威胁着人类健康乃至整个生物圈的生态平衡，已引起世界极高度的关注，而寻求一种取代传统抗生素的无残留、无耐药性的新型抗菌药物已成为当务之急。抗菌肽具有高效的抑菌效果和广泛而稳定的生物学活性，已经广泛引起人们的兴趣和关注。抗菌肽不仅具有广谱、高效的抗微生物活性，而因其独特的抗菌机理不会使微生物产生耐药性，在机体内无残留，具广阔的开发应用前景，抗菌肽的应用必将带来一场抗生素新的革命。

我国作为世界养牛业大国，牛血来源丰富、开发不充分、价格低廉，可以满足大规模深化加工的需求，具有很强的开发应用及推广价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗菌肽的制备方法，其制备方法条件温和、无污染、效率高。为了实现上述目的，本发明提出如下技术方案：

一种抗菌肽的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)取牛血，进行血细胞破碎(目的是释放血红蛋白)后加入菠萝蛋白酶进行酶解；

(2)向酶解液中加入乙酸浸提，离心取上清，调节pH至6.0±0.5(如6.0)，获得牛血抗菌肽粗提物；

(3)将所述牛血抗菌肽粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰；

(4)将步骤(3)收集的具有抗菌活性的洗脱峰上样于SephadexG-25凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，获得牛血抗菌肽溶液；

(5)将步骤(4)收集的牛血抗菌溶液冷冻干燥。

在所述方法的步骤(1)中，所述菠萝蛋白酶与所述牛血的配比可为750-35000U：100ml(如1750-3500U：100ml，具体如3500U:100mL)；所述酶解的温度可为70～90℃(如70℃)，时间可为4～6h(如4h)。另外，在本发明中，所述进行血细胞破碎具体通过采用组织捣碎机搅拌所述牛血实现的。

在本发明中，所述菠萝蛋白酶的酶活为3500U/mg。相应的，所述菠萝蛋白酶与所述牛血的配比可为0.5-10mg：100ml(如0.5-1mg：100ml，具体如1mg:100mL)。

在所述方法的步骤(2)中，所述向酶解液中加入乙酸具体可为：向所述酶解液中加入等体积的5％(体积百分含量)的乙酸水溶液；所述浸提具体可为：4～37℃(如4℃～10℃，再如4℃)震荡16-20h(如16h)；所述离心为：6600g-10000g(如10000g)4～10℃(如4℃)离心20min～30min(如20min)。

在所述方法的步骤(3)中，所述洗脱液具体可为：pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm²·h。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)的洗脱过程中共产生两个洗脱峰，所述具有抗菌活性的洗脱峰实际为第二个洗脱峰。所述抗菌活性具体体现为抗如下细菌中的至少一种：大肠杆菌(如ACTT25922)、绿脓杆菌(如ACTT27853)、嗜水气单胞菌(GenebankIDSequenceID:gb|KJ156374.1|)。

在所述方法的步骤(4)中，所述洗脱液具体可为：pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm²·h。

在本发明的一个实施例中，步骤(4)的洗脱过程中只产生一个洗脱峰，该洗脱峰即为纯化后的牛血抗菌肽样品。

在所述方法的步骤(3)中，SephadexG-100凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言，本发明中所采用的SephadexG-100凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0061-02)。所述上样的上样量为10ml；所述洗脱的洗脱体积为1-1.5L。

在所述方法的步骤(4)中，SephadexG-25凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言，本发明中所采用的SephadexG-25凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0033-1。所述上样的上样量为10ml；所述洗脱的洗脱体积为1-1.5L。

在上述方法中，所述牛血即可为新鲜的牛血，也可以为经冷冻后融化的牛血。

利用如上所述方法提取得到的牛血抗菌肽也属于本发明的保护范围。

具体而言，本发明具有以下优点：