[发明专利]一种黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种石蜡切片的制作方法，尤其涉及一种黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法。

背景技术

黄石爬鮡(EuchiloglaniskishinouyeiKimu-ra)，属鲇形目(Siluriformes)、鮡科(Sisoridae)、石爬鮡属(EuchiloglanisRegan)，主要分布于长江流域的岷江水系和金沙江水系，海拔1800-3600m处，是高山峡谷，陡坡急流及枯洪流量的环境中生活的小型底栖淡水鱼类(诸新洛等1999，唐文家等2011)，并且是鰋鮡鱼类除原鮡外，最为原始的种类，因其生态分布的特殊性，是研究鱼类进化及系统分类学重要材料。由于酷捕，黄石爬鮡的天然资源量急剧减少，已处于濒危状态，亟待采取有效措施加以保护(郭宪光等2004，汪摇松等2004)。

为研究黄石爬鮡皮肤的基本结构及其粘液细胞在鱼体皮肤里的分布情况，为探讨外界环境对鱼体生理机能的影响提供一些直观的参考，需要对黄石爬鮡皮肤作石蜡切片。但由于黄石爬鮡皮肤真皮层中富含有脂肪，制作石蜡切片时经常出现破碎、挤压或切片不完整的现象，且传统石蜡切片的制作时间长，染色效果不理想，为了解决这一问题就需要对常规的石蜡切片制作方法进行改进。

中国专利(CN103257055A)公开的一种三角帆蚌外套膜组织切片的制备方法，组织酒精梯度脱水时省去了95％酒精的梯度，浸蜡时间也减少，大大缩短了传统的制作切片的时间，但此方法对于富含有脂肪的黄石爬鮡皮肤真皮层石蜡切片的制作没有作用，且省去95％酒精梯度对皮肤脱水不彻底，造成组织破碎，真皮层与表皮层脱离等问题，导致黄石爬鮡皮肤组织切片的失败。因此，如何调整脱水和浸蜡时间，是亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是黄石爬鮡皮肤真皮层中富含有脂肪，制作石蜡切片时经常出现破碎、挤压或切片不完整的现象，且传统皮肤切片的制作时间长，染色效果不理想。

为解决上述问题，本发明经过一系列的实验：包括方法的筛选、条件的优化及重复实验，建立了一整套的适用于黄石爬鮡皮肤切片的材料固定、处理和组织切片方法，包括样品固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片与展片、染色与封片五个步骤，且在样品固定后，经流水冲洗1.5-2.5h后再进行脱水处理；脱水与透明、浸蜡与包埋的总时间，即从组织脱水到组织包埋只需要12.5h。

进一步的，所述样品固定步骤为将黄石爬鮡皮肤取下后，用生理盐水清洗后，将皮肤修成1cm×0.5cm×0.5cm大小的组织，投入波恩氏液中固定。所述波恩氏液的配方为：苦味酸饱和水溶液75ml，福尔马林(40％甲醛液)25ml，冰醋酸5ml。

进一步的,所述脱水与透明步骤为用梯度乙醇脱水：先后采用浓度为70％的乙醇处理2-12h、80％的乙醇处理1.8-2.2h、90％的乙醇处理70-80min、第一次95％的乙醇处理40-50min、第二次95％的乙醇处理0.8-1.2h、第一次100％的乙醇处理25-35min、第二次100％的乙醇处理25-35min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯透明预处理25-30min、再用二甲苯处理2次，每次10-20min，使之透明。

优选为先后采用浓度为70％的乙醇处理2h、80％的乙醇处理2h、90％的乙醇处理75min、第一次95％的乙醇处理45min、第二次95％的乙醇处理1h、第一次100％的乙醇处理30min、第二次100％的乙醇处理30min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯透明预处理30min、再用二甲苯处理2次，每次15min使之透明。

进一步的，所述浸蜡与包埋步骤为用体积比为1:1的二甲苯：石蜡进行浸蜡预处理25-35min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次85-95min；最后将组织样品用纸盒进行包埋。

优选为所述浸蜡与包埋步骤为用体积比为1:1的二甲苯：石蜡浸蜡预处理30min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次90min，最后将组织样品用纸盒进行包埋。

进一步的，所述切片与展片步骤为用切片机切片，切片厚度控制在5μm-7μm，经35℃-38℃水浴锅中进行展片，用涂有蛋白甘油的载玻片捞片后，在35℃-38℃的烘箱中进行烘片。