[发明专利]一种基于hSCARB2基因敲入的肠道病毒71型感染模型的构建方法及所述感染模型的用途

权利要求书

1.一种构建肠道病毒EV71型感染的小鼠模型的方法，其包括以下步骤：

1)向小鼠的Rosa26基因中定点插入人hSCARB2基因，获得基因敲入小鼠；以及

2)将1)中获得的基因敲入小鼠与对应的工具小鼠交配，启动hSCARB2基因表达，获得在特定组织内特异表达hSCARB2基因的基因敲入小鼠。

2.权利要求1的方法，其中所述方法还包括获得权利要求1中所得的小鼠模型的后代小鼠。

3.权利要求1的方法，其中所述步骤1)包括：

(1)利用小鼠胚胎干细胞敲入hSCARB2基因

通过分子载体构建技术获得能够与基因组内基因位点发生同源重组的打靶载体；利用电转染技术将打靶载体导入胚胎干细胞，挑取抗药性胚胎干细胞，PCR和Southern印迹筛选出正确打靶的胚胎干细胞克隆；以及

(2)小鼠胚胎干细胞囊胚显微注射和种系遗传

选取其中的阳性胚胎干细胞克隆，并利用显微操作仪将其注入小鼠囊胚，从而形成由野生型细胞和基因敲入的胚胎干细胞共同组成的嵌合体小鼠，胚胎干细胞在分化过程中能够进入生殖系，形成嵌合体小鼠的生殖细胞，再经过交配把改造后的基因遗传给子代，获得基因敲入小鼠。

4.权利要求3的方法，其中所述打靶载体具有突变的人hSCARB2基因、同源臂和抗性基因。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中小鼠选自C57BL/6、BALB/c、ICR或KM小鼠。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中工具小鼠为表达Cre重组酶的工具小鼠。

7.权利要求3的方法，其中所述打靶载体为通过人hSCARB2基因的cDNA而改造的打靶载体。

8.权利要求7的方法，其中所述打靶载体包含启动子、终止信号以及加强mRNA转录稳定性的元件。

9.权利要求8的方法，其中所述打靶载体为Ai3载体，其依次包含一个强CAG启动子，一个两侧有loxP的终止信号，以及一个加强mRNA转录稳定性的WPRE元件。

10.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述打靶载体中，人hSCARB2基因的后面插入tdTomato报告基因。

11.权利要求10的方法，其中所述报告基因所编码的酶与人hSCARB2通过2A短肽有效连接。

12.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述方法还包括鉴定基因敲入小鼠的基因型和表型。

13.权利要求12所述的方法，其中通过PCR、Sourthern印迹方式鉴定基因敲入小鼠的基因型，和/或通过real-time RT PCR、Western印迹、免疫荧光方式鉴定人hSCARB2基因的表达以及分布。

14.权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括：

用EV71毒株感染所获得的小鼠模型。

15.权利要求14所述的方法，其中EV71毒株为带有报告基因的EV71阳性株。

16.权利要求15所述的方法，其中报告基因为EFGP报告基因。

17.权利要求15所述的方法，其中所述EV71阳性株为带有EGFP报告基因的EV71阜阳株。

18.权利要求14所述的方法，其中感染包括以尾静脉注射、腹腔注射、皮下注射、灌胃或呼吸道方式感染。