[发明专利]一种基于hSCARB2基因敲入的肠道病毒71型感染模型的构建方法及所述感染模型的用途

说明书

本发明涉及一种基于hSCARB2基因敲入的肠道病毒71型感染模型的构建方法及所述感染模型的用途，特别用于为EV71疫苗和抗病毒药物的体内评价提供了有效手段。

技术领域：

本发明涉及一种肠道病毒EV71型感染模型的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明所构建的动物模型可用于EV71病毒感染机制的研究，以及EV71病毒疫苗保护力的体内验证、新型EV71疫苗的研发和抗病毒药物筛选。

背景技术

人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是手足口病(hand,foot and mouthdisease,HFMD)的主要病原之一，主要感染5岁以下儿童，可引起神经系统感染导致无菌性脑膜炎、脑干脑炎，以及心肌炎、肺水肿等。EV71已在世界范围内引起多次零星的流行，尤其在亚洲环太平洋地区频频爆发，包括日本、马来西亚、新加坡、中国内陆和中国台湾等，给这些国家和地区造成了严重的社会危害。在我国，自从2008年手足口病爆发以来，近年手足口病发病率呈上升趋势，其中重症和死亡病例多是由EV71感染引起，EV71感染已成为严重的社会和公共卫生问题。疫苗是控制疾病流行的最有效手段之一。多种疫苗目前正处于研发阶段，因此亟需能够辅助疫苗研究的理想的EV71感染模型。

目前，已经有一些非人灵长类和小鼠的EV71感染模型。其中，石蟹猴和恒河猴模型对EV71感染敏感，并且能表现出与人类EV71感染后相类似的临床症状[1,2,3]。然而，由于伦理问题和经济原因，非人灵长类模型很难被广泛应用。而小鼠模型，仅有乳鼠和免疫缺陷鼠能感染EV71，并导致皮肤破损、共济失调和死亡等。但是由于乳鼠和免疫缺陷鼠不能产生抗体，故都不适用于疫苗效力的评估[4,5,6]。虽然通过对母鼠免疫，乳鼠也能够获得母传抗体，从而间接评估疫苗免疫所诱导产生的抗体及保护效力。但是这种方法的检测不直接、不准确，并不是评估疫苗效力的理想模型。因此，建立一个成年的、免疫系统健全的小鼠模型对于疫苗效力的体内评价是非常有意义的。

为了达到这个目标，日本和台湾已分别建立了转入EV71受体基因hSCARB2(scavenger receptor class B member 2)的小鼠模型。其中，台湾Lin等人的研究团队建立的hSCARB2转基因模型仍然受周龄的限制，仅2周以下的小鼠能够感染，并且其感染后的病理表现也类似于乳鼠模型[7]。而日本Fujii等人的研究证明，6周的hSCARB2转基因小鼠也对EV71感染敏感，并且神经系统出现了病理改变。但是在这一成年模型中没有出现手、足、口方面的症状，也没有出现肺水肿[8]。而为本领域人员熟知的是，手足口症状是感染相关肠道病毒后非常普遍的临床症状，肺水肿是导致患儿死亡的重要原因之一(Abzug MJ,2014.The enteroviruses:problems in need of treatments.J Infect.Suppl 1:S108-14)。

为了获得能更加模拟临床症状的EV71感染模型，我们构建了hSCARB2基因定点敲入模型，并且证明它不但对EV71感染敏感，而且能够表现出人类手足口病症中的多种临床特征。

此外，目前已有报道的与EV71病毒相关的模型均为通过原核转基因方式制作[7,8]。原核注射方式转基因往往为随机插入宿主基因组，一是会导致首建鼠之间拷贝数不一致，二是会导致插入位点不一致。所以，转基因动物模型会出现表型不稳定、转基因不稳定的现象。而基于干细胞技术建立的定点插入外源基因的转基因方法，能较好的解决上述问题，获得的模型更加稳定。

为了验证本发明建立模型的有效性，我们通过EV71病毒攻毒、接种疫苗和抗体等多种实验进行了验证。

发明内容

在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种构建肠道病毒EV71型感染模型的方法，其包括以下步骤：

1)向鼠科动物(优选大鼠或小鼠)中定点插入人hSCARB2基因，获得基因敲入动物；