[发明专利]一种小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒及制备、使用方法

权利要求书

1.一种小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：本试剂盒的原料配方为：1000~2000μL反应液、100~200μL酶混合液、100~200μL荧光探针、100~200μL阳性对照、100~200μL阴性对照和2~3mL超纯水；反应液包括一步法RT-PCR缓冲液、OligodTPrimer、引物混合液、Mg²⁺及dNTP，五种液体于反应液中体积比为12:1:1:2:18；酶混合液包括TaKaRaExTaqHS和反转录酶PrimeScriptRTase、RNases抑制剂，三种溶液于酶混合液中体积比为1:40:8。

2.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：引物混合液为针对小反刍兽疫病毒全基因特异性引物Pa与Pb，浓度为10μmol/L；荧光探针为针对小反刍兽疫病毒全基因特异性Ps，探针5’端标记FAM基团，3’端标记TAMRA基团，浓度为10μmol/L，引物序列见表1：

表1引物（Pa与Pb、Ps）序列

引物序列（5’—3’）PaCCAGCAATCGGACCAAACAAAGPbACGCTGTACTTGAGAGTTGGATCPsAGCCCAGCCTCACAGTCGTTGCCA

。

3.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：一步法RT-PCR缓冲液为OneStepRT-PCRBuffer，它包括20mmol/LTris-HCl、100mmol/LKCL和质量分数为0.1%明胶。

4.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：OligodTPrimer浓度为50μmol/μL；Mg²⁺为MgCl₂溶液，其浓度为25mmol/L。

5.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：dNTP为dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在内等量混合游离核苷酸，其浓度为10mmol/L。

6.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：TaKaRaExTaqHS浓度为5.0U/μL；PrimeScriptRTase浓度为200U/μL。

7.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：RNases抑制剂浓度为40U/μL。

8.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：阳性对照为小反刍兽疫病毒全基因中部分序列克隆质粒混合物，其浓度为1.7×10⁷copies/μL。

9.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：阴性对照为不含小反刍兽疫全基因序列的pMD19-T空载体质粒。

10.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于：超纯水为无RNase双蒸水。