[发明专利]一种小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒及制备、使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小反刍兽疫一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒及制备、使用方法。

背景技术

小反刍兽疫（Pestedespetitsruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类疫病，我国规定其为一类疫病。临床上主要以高热、口炎、腹泻和肺炎为主要特征。本病传播快，发病率、死亡率均高，是严重危害养羊业的重大疾病之一。

目前国内外可用于检测小反刍兽疫病毒的方法包括琼脂凝胶免疫扩散（AGIA）、对流免疫电泳（CIEP）、病毒中和试验（VNT）、酶联免疫吸附法（ELISA）、RT-PCR等，其中AGIA、VNT等传统方法要么操作复杂费时较长，要么灵敏度或特异性不高，存在各种各样的问题，不适合应用于PPR疫情的大规模检测。ELISA方法相对于传统的VNT等方法更加方便快捷，但也存在一定的缺点，例如不能区分PPR与牛瘟的感染。而RT-PCR方法具有快速、准确、灵敏、特异等优点，尤其是实时荧光定量RT-PCR方法比普通RT-PCR特异性更强，敏感度更高，同时一步法实时荧光定量RT-PCR更是有效的解决了两步法RT-PCR容易污染的问题。因此，本发明设计了针对小反刍兽疫病毒全基因的特异性引物，通过优化反应条件，建立一种快速、特异、高度敏感的PPRV诊断方法，为PPR防控提供了一定的技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，提供一种比普通RT-PCR更快速、更有效、更特异、更敏感的小反刍兽疫病原检测诊断试剂盒及制备、使用方法，以提高特异性，缩短检测时间，提高检出率，为PPR防治提供更好的技术支持，同时克服现在技术存在的诊断成本高且难度大、耗时长，容易出现假阳性等不足。

本发明的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂，其原料配方为：

1000~2000μL反应液，100~200μL酶混合液，100~200μL荧光探针、100~200μL阳性对照、100~200μL阴性对照和2~3mL超纯水。反应液包括一步法RT-PCR缓冲液、OligodTPrimer、引物混合液、Mg²⁺及dNTP,五种液体于反应液中体积比为12:1:1:2:18；酶混合液包括TaKaRaExTaqHS和反转录酶PrimeScriptRTase、RNases抑制剂，三种溶液于酶混合液中体积比为1:40:8；引物混合液为针对小反刍兽疫病毒全基因特异性引物Pa与Pb，浓度为10μmol/L；荧光探针为针对小反刍兽疫病毒全基因特异性Ps，探针5’端标记FAM基团，3’端标记TAMRA基团，浓度为10μmol/L，引物序列见表1：

表1引物（Pa与Pb、Ps）序列

引物序列（5’—3’）PaCCAGCAATCGGACCAAACAAAGPbACGCTGTACTTGAGAGTTGGATCPsAGCCCAGCCTCACAGTCGTTGCCA

所述一步法RT-PCR缓冲液为2×OneStepRT-PCRBuffer，它包括20mmol/LTris-HCl（PH8.3）、100mmol/LKCL、质量分数为0.1%明胶。

所述OligodTPrimer，其浓度为50μmol/μL。

所述Mg²⁺为MgCl₂溶液，其浓度为25mmol/L。

所述dNTP为dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在内等量混合游离核苷酸，其浓度为10mmol/L。

所述TaKaRaExTaqHS，其浓度为5.0U/μL。