[发明专利]一种海洋生物肽Xen2174的合成方法

说明书

本发明涉及一种Xen2174肽的合成方法，先固相合成线性肽，然后定向形成两对二硫键，即通过固相氧化形成第一对二硫键(即4‑13二硫键)，通过液相辣根过氧化物酶氧化形成第二对二硫键(即5‑10二硫键)，粗肽经纯化得到Xen2174精肽。该方法具有操作简单、工艺简化、合成条件温和、环境友好、经济效益高、可规模化生产等优点。

技术领域

本申请涉及多肽合成技术领域，具体而言涉及一种海洋生物肽Xen2174的合成方法。

背景技术

Xen2174肽是一种由13个氨基酸组成且含有两对二硫键的多肽，肽序如下：

pGlu-Gly-Val-Cys-Cys-Gly-Tyr-Lys-Leu-Cys-His-4Hyp-Cys-NH₂，二硫键连接方式为4-13和5-10，分子量为1404.68。

Xen2174肽属于χ-芋螺毒素，是由海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)分泌的生物活性肽类毒性物质，这类生物活性肽被统称为芋螺毒素(conotoxin或conopeptide)。Xen2174肽是高选择性的去甲肾上腺素转运体(NET)抑制剂，其在动物疼痛模型上具有高的治疗指数，并且没有观察到副作用。Xen2174肽已被澳大利亚Xenome公司开发成药物并已进入II期临床试验，该药物通过鞘内注射来减轻神经性疼痛。

到目前为止，只有专利文献US 20090088389A1和非专利文献(Chem.Commun.，2014，50，8408-8411)公开了两种制备Xen2174肽的方法.

第一种方法(见图1)：使用氨基树脂，通过标准的Fmoc固相肽合成制备线性肽，然后在液相中通过DMSO氧化形成两对二硫键(4-13，5-10)，采用反相高效液相色谱法纯化得到Xen2174精肽。此方法的缺点在于不能定向氧化形成两对二硫键，存在二硫键的错配杂质，产率较低.

第二种方法(见图2)：使用氨基树脂，通过标准的Fmoc固相肽合成制备肽树脂，裂解得到线性肽后，在液相中先氧化形成第一对二硫键4-13，然后通过碘氧化形成第二对二硫键5-10。粗肽经反相高效液相色谱法纯化得到Xen2174精肽。此方法的缺点在于通过碘氧化形成第二对二硫键时，很容易将此肽中7号位的Tyr碘代，导致杂质增多，同时过量的碘很难除掉。产率很低。

本发明提供一种Xen2174肽的合成方法，先固相合成线性肽，然后定向形成两对二硫键，即通过固相氧化形成第一对二硫键(即4-13二硫键)，通过液相辣根过氧化物酶氧化形成第二对二硫键(即5-10二硫键)，粗肽经纯化得到Xen2174精肽。该方法具有操作简单、工艺简化、合成条件温和、环境友好、经济效益高、可规模化生产等优点。

发明内容

本发明提供一种止痛药物Xen2174肽的合成方法，其包括以下步骤：

步骤(1)：按照Fmoc固相合成方法，在树脂上依次偶联各Fmoc-AA-OH；

步骤(2)：固相脱除肽链第4位和第13位半胱氨酸残基上的保护基；

步骤(3)：通过固相氧化形成第一对二硫键，即4-13二硫键；

步骤(4)：脱除树脂，第5位和第10位半胱氨酸残基上的保护基同时被脱除；

步骤(5)：通过液相氧化形成第二对二硫键，即5-10二硫键；以及

任选的步骤(6)：纯化。

步骤(1)中所使用的树脂为氨基树脂，可选自Rink Amide-AM树脂、MBHA树脂、PAL树脂等。优选地，树脂替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.2-0.5mmol/g，最优选0.303mmol/g.