[发明专利]用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签，用于超高通量基因测序。

背景技术

微生物群落多样性是微生物生态学和环境学研究的重点之一。目前利用宏基因组研究微生物多样性越来越受到科学家们的关注，但由于对于同一个样本来说，宏基因组研究的结果中往往细菌的数量占大多数而使得真菌等微生物种类远少于细菌。这对于某些领域的研究非常不利，如对酿酒过程中各个时期的微生物种群研究，真菌的作用远高于细菌，对酒类品质的影响较大。因此利用真菌独特的内转录间隔区序列为靶序列，用PCR扩增的方法从复杂样本中富集真菌DNA成为非常有效的方法。

Handelman(HandelsmanJ,RondonMR,BradySF.molecularbiologialaccesstothechemistryofunkownsoilmicrobes:Anewfrontierfornaturalproducts[J].1998,5(10):R245-R249.)等(1998)首次提出宏基因组的概念，其定义为“thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature”，即环境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因组总和。本发明所指的宏内间隔序列是指环境中全部真菌内间隔序列的总和，为微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的提供了一条新的思路。

核糖体RNA(rRNA)由于功能上高度保守，序列上不同位置具有不同的变异速率，是目前在微生物分子生态学上应用最广泛的分子标记。真核生物基因组中编码核糖体RNA的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA4种，它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔(匡治州,许杨.核糖体rDNAITS序列在真菌学研究中的应用[J].生命的化学,2004(02):120-122.)。其中18S、5.8S和28SrDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守，适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析，其间的间隔区为内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer，ITS)，包括18S和5.8S之间的内转录间隔区1(ITS1)及5.8S和28S之间的内转录间隔区2(ITS2)两部分，由于ITS不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长度为1000bp到小于300bp大小不等，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究(IwenPC,HinrichsSH,RuppME.Utilizationoftheinternaltranscribedspacerregionsasmoleculartargetstodetectandidentifyhumanfungalpathogens[J].MedMycol,2002,40(1):87-109)。

发明内容

本发明提供一种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签及其应用，提高超高通量测序的样本通量，有效降低超高通量测序成本，有效富集样本中整个微生物种群中的真菌种群，为探明环境中真菌多样性研究提供高通量分析途径。

一种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签，其序列如如下序列编号NO.1～NO.48所示。

本发明复合标签的每一条序列由左侧8-10个碱基组成具唯一性标签和右侧21个源于真菌内转录间隔区1的序列组成的标签复合而成。

表1

本发明还提供一种真菌高通量基因测序方法，包括如下步骤：

(1)提取每一个样本的总DNA；

(2)对每一个样本，从权利要求1中所示48对且未被选择过的序列中选择任一一对序列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；

(3)对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；

(4)对每个样本纯化回收后的产物紫外分光光度计精确定量；

(5)将所有样本等量混合后建立一个测序文库；

(6)对所建测序文库进行高通量测序。