[发明专利]一种在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法。本发明可用于高效地制备非人基因突变动物。

背景技术

基因突变能改变特定基因的DNA核苷酸序列，具体种类包括碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。基因突变造成特定基因产物的表达量或者功能发生变化，从而导致细胞水平上的生物学过程发生改变，以及动物个体水平上的表型发生异常(Griffiths等编著的《IntroductiontoGeneticAnalysis》第十版)。

携带基因突变的实验动物模型在生物学研究和新药开发中是非常重要的资源。在生物学研究中，携带随机基因突变的动物可被用于发现具有特定功能的新基因。针对携带基因突变的动物进行的表型分析有助于发现特定基因的新功能。在新药开发领域，携带致病基因突变的动物可用于模拟人类疾病，以及研究疾病发生机理。此外，基因突变疾病动物模型还可以在临床前试验中用于筛选能缓解疾病表型的新药，以及确定新药的安全性和有效性。当特定基因突变在动物模型中引起抗疾病表型时，相应基因可被直接候选为新型的药物靶点。

现有制备基因突变动物的方法主要涉及离体胚胎干细胞基因操作(Bradley等，1984，Nature309：255-256；Thomas和Capecchi，1987，Cell51：503-512)和离体受精卵原核显微注射(Behringer等编著的《ManipulatingtheMouseEmbryo：ALaboratoryManual》第四版)。这些制备方法花费大，耗时长，技术要求高，而且在制备基因突变动物过程中还需要将离体细胞植入假孕雌性动物体内。

雄性动物睾丸内的精原干细胞可以分化形成成熟的精子，是另一种可被用于制备转基因动物的细胞源。将整合型慢病毒(Lentivirus)注射入正处于发育阶段的睾丸内，可以直接感染体内精原干细胞(Sehgal等，2011，PLoSOne6：e21975)。该方法可以简单易行地对非人动物进行在体基因操作。但在诱导基因突变方面，由于整合型慢病毒偏好插入于基因组中具有转录活性的区域，故无法做到完全地介导覆盖全基因组地随机插入(Schroder等，2002，Cell110：521-529；Mitchell等，2004PLoSbiology2；e234)。

发明内容

为了能高效地制备携带随机插入突变的基因突变动物，本发明提供了一种携带piggyBac转座子系统的非整合型慢病毒复合载体及其制备方法，以及应用该复合载体在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法。

转座子插入突变技术是另一种在实验动物中引入插入突变的方法。piggyBac转座子(PB)系统是现有在哺乳动物中诱导插入突变效率最高的转座子系统(Ding等，2005，Cell122：473-483；Wang等，2008，Proc.Natl.Acad.Sci.USA105：9290-9295)。piggyBac转座子早先于粉斑夜蛾(Trichoplusiani)的基因组中被发现，大小为2472bp，两端包含反向末端重复序列(ITR)，中间包含编码594个氨基酸的转座酶。piggyBac转座子类属于DNA转座子，通过剪切和粘贴机制可以由位于外源DNA或内源基因组的起始位点切离，并插入基因组中的另一位点。piggyBac转座子插入靶位点的序列为四核苷酸的TTAA。piggyBac转座子在切离TTAA时一般不会改变原位点及原位点的附近序列，即所谓无痕转座。piggyBac转座子在插入基因组时，不存在位点偏好性，随机整合入基因组，因此是介导覆盖全基因组地随机插入突变优选的遗传工具(Cary等，1989，Virology172：156-169；Fraser等，1995，Virology211：397-407；Fraser等，1996，InsectMolecularBiology5：141-151)。但是作为一种非病毒载体，生物技术领域至今仍缺乏一种有效利用piggyBac转座子系统在体递送制备基因突变动物的方法。

本发明在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变时利用了一种携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒复合载体，该复合载体中包含的元件从5’端到3’端分别是：