[发明专利]一株高效利用乳清产乙醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法

说明书

一株高效利用乳清产燃料乙醇酿酒酵母工程菌。本发明提供的酿酒酵母菌，是选用强启动子PGK1分别表达乳糖分解酶基因LAC4及乳糖通透酶基因LAC12，同时敲除MIG1、NTH1以及GAL6基因，在缓解葡萄糖阻遏现象的同时消除酿酒酵母菌自身的半乳糖代谢调控，得到一株具有高耐性的高效利用乳清中乳糖产乙醇酿酒酵母工程(Saccharomyces cerevisiae)AY5MG，保藏号为CGMCC No.11223。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下，能够在乳清浓度为120g/L(乳糖含量为53.1g/L)的培养基中生长、发酵产乙醇，发酵周期为54h，乳清中乳糖利用率为98.7％，无水乙醇对乳糖得率为49.7％(相当于理论得率的92.3％)；同时缓解了葡萄糖对半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖同时被利用；在含有19％(v/v)乙醇，或者发酵温度为39℃时可以正常发酵。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株既缓解半乳糖代谢调控又提高了抗逆性的高效利用乳清的酿酒酵母工程菌及其构建方法。

背景技术

乳清是指在制造干酪或干酪素时，分离出絮凝物后剩下的极稀薄的液体，是工业生产干酪及干酪素的副产品，每生产1t的干酪产生9t乳清，含有牛奶中55％的营养，但是由于乳清具有很高的BOD和COD，所以对环境造成很大的负担。目前，全球乳清产量约为16亿吨，而只有其中的50％得到处理，用于食品、饲料等方面，剩下的约8亿吨没有得到有效利用，被排泄到自然界中，不但造成环境的污染，而且还造成该资源的巨大浪费。乳清中除了含有20％乳品蛋白外，含量最多的是乳糖，约占乳清5％左右，是产生高BOD和COD的主要原因。

如何利用乳清中的乳糖，从而减低乳清对环境的污染一直是乳制品行业关注的问题。乳糖的利用主要有以下几个方向：用于食品行业、用于饲料行业、用于医药行业。但是随着全球能源危机的加剧，以及世界粮食安全问题等因素，乳清成为新的生产燃料乙醇的主要原料，也使得利用乳清生产燃料乙醇成为一个全新的热点。

目前国外利用乳清生产燃料乙醇已有40多年的历史，所使用的菌种主要有克鲁维酵母和酿酒酵母。克鲁维酵母虽然能够利用乳清，但是该属酵母酒精产率低，抗逆性差，菌体生长量大，不适用于生产乙醇。酿酒酵母虽然是生产乙醇的最佳首选，但是野生型酿酒酵母不能够利用乳清为唯一碳源，所以如何改造酿酒酵母，使其可以发酵乳清产乙醇，一直是科研人员的研究热点。目前国外的解决方法主要分为以下几种：一、是利用原生质体融合技术，对酿酒酵母及克鲁维酵母进行融合，筛选既可以利用乳糖又能高效产乙醇的突变株；二、是采用基因工程手段，把外源基因导入到酿酒酵母体内，使得酿酒酵母具有分解乳糖的能力，从而解决其不能利用乳清的问题。目前导入最多的外源基因为克鲁维酵母的LAC4基因(编码乳清分解酶)和LAC12基因(编码乳清通透酶)。但是上述两种方法所构建的菌株均存在乳清利用缓慢、发酵周期长等问题。