[发明专利]乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒

权利要求书

1.RECQL、RECQL4及RECQL5基因的mRNA表达作为联合标志物在制备乳腺癌检测和/或疗效评价试剂中的应用。

2.乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，其特征在于，包括RECQL、RECQL4及RECQL5基因的特异性扩增引物及探针，探针的核苷酸序列5’端连接有荧光报告基团，非5’端连接有荧光淬灭基团，其中

RECQL扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO1~2所示，

RECQL特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

RECQL4扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:4 ~5所示，

RECQL4特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

RECQL5扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:7 ~8所示，

RECQL5特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.根据权利要求2所述的乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，其特征在于，还包括内参基因GAPDH的特异性扩增引物及探针，

GAPDH扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:10~11所示，

GAPDH特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

探针的核苷酸序列5’端连接有荧光报告基团，非5’端连接有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求2或3所述的乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，其特征在于，探针的核苷酸序列5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。

5.一种乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，其特征在于，包括权利要求2~4任一所述的检测乳腺癌的特异性RT-PCR引物和探针。

6.根据权利要求5所述的乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，其特征在于，还包括阳性模板，阳性模板包括纯化后的：RECQL基因扩增产物、RECQL4基因扩增产物、RECQL5基因扩增产物和GAPDH基因扩增产物。

7.根据权利要求6所述的乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，其特征在于，分为RECQL、RECQL4、RECQL5和GAPDH这4个基因的实时荧光定量PCR反应体系和这4个基因的阳性模板体系，其中，

每个基因的实时荧光定量PCR反应体系19.0μL，包括PCR反应缓冲液10μL、浓度10μM的该基因扩增引物各0.8μL、浓度2μM的该基因特异性探针1.0μL和RNase-free water7.2μL；

每个基因的阳性模板体系包括浓度为1×109拷贝/μL的纯化后的该基因扩增产物。

8.RECQL、RECQL4及RECQL5基因的mRNA表达作为联合标志物在制备乳腺癌检测和/或疗效评价试剂中的应用，其特征在于，所述试剂采用权利要求6或7所述的乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，试剂盒的使用包括以下步骤：

将RECQL、RECQL4、RECQL5和GAPDH这4个基因的阳性模板进行梯度稀释后加入实时荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应，根据稀释拷贝数和扩增Ct值，绘制每个基因的定量标准曲线；

待检测样本提取总RNA后逆转录为cDNA，以该cDNA为荧光定量PCR模板，加入实时荧光定量PCR反应体系后，进行荧光定量PCR反应，所得扩增Ct值带入相应基因的定量标准曲线，得到样本中该基因的初始表达量；

待检测样本的测定结果用该样本的内参基因GAPDH的结果进行归一化处理，处理后按方程y=x1+42.016×x2+7.87×x3计算RECQL、RECQL4和RECQL5三个标志物基因的联合预测因子，其中y表示联合预测因子，x1表示样本RECQL基因的表达量，x2表示样本RECQL4基因的表达量，x3表示样本RECQL5基因的表达量；

y小于0.006时待检测样本为阳性，y大于0.006时待检测样本为阴性。