[发明专利]一种仔猪心肌成纤维细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种猪心肌成纤维细胞分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）心肌组织采样:无菌条件下取出仔猪心脏，放入盛有50mL预冷PBS烧杯中；

在无菌操作台，选取小猪心室，剔除心薄膜组织，用预冷PBS漂洗多次，把组织剪成苹果泥状；

2）心肌组织消化:将剪碎组织转移到锥形瓶中，加入含DNA酶的混合酶液消化；

3）移取上层清液，加入含10%~15%胎牛血清的高糖DMEM培养液终止消化，用100μm和40μm滤筛分别过滤，如此重复，直至组织消化完全；

4）收集细胞悬液后离心弃上清，加入红细胞裂解液，混匀离心，用含10%~15%胎牛血清DMEM高糖培养液重悬细胞；

5）心肌成纤维细胞培养：将得到细胞转移至细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中进行差数贴壁；

6）弃去上层清液，更换新的培养基继续在培养箱中培养。

2.在分离心肌成纤维细胞之前还包括以下前处理步骤：

1）将组织处理器械和玻璃器皿清洗烘干，用牛皮纸包好放入高压灭菌锅，121℃灭菌20~30min；

2)配制消毒液：取新洁尔灭，用蒸馏水稀释到终浓度为0.1%后，对仔猪皮肤表面进行消毒。

3.根据权利要求1所述仔猪心肌成纤维细胞分离培养方法，其特征在于：消化时，使用0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶1：1混合酶液，用量是心肌组织体积3~5倍。

4.根据权利要求1所述仔猪心肌成纤维细胞分离培养方法，其特征在于：加入含DNA酶（0.02mg/mL）3~5mL的消化液消化组织。

5.根据权利要求1所述仔猪心肌成纤维细胞分离培养方法，其特征在于：在步骤2)中，终止消化用含10%~15%胎牛血清DMEM高糖培养液，滴加量为5～15mL。

6.根据权利要求1所述仔猪心肌成纤维细胞分离培养方法，其特征在于：在37℃水浴锅中消化15min左右，弃去上次清液，继续加入混合消化液消化8~10min，移取上层清液加入离心管中终止消化，如此重复3～8次，直到组织块完全消化为止。

7.根据权利要求1所述仔猪心肌成纤维细胞分离培养方法，其特征在于：红细胞裂解液用量是3~5mL。

8.根据权利要求1所述仔猪心肌成纤维细胞分离培养方法，其特征在于：收集细胞悬液至于冰上低温保存。

9.根据权利要求1所述仔猪心肌成纤维细胞分离培养方法，其特征在于：差数贴壁两次，每次60~90min，以除去还没有贴壁的心肌细胞，纯化心肌成纤维细胞。

10.根据权利要求1所述仔猪心肌成纤维细胞分离培养方法，其特征在于：培养过程使用含10%~15%胎牛血清DMEM高糖培养液，每隔2~3天更换培养液。