[发明专利]一种仔猪心肌成纤维细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪心肌成纤维细胞分离培养方法，属于现代生物技术的细胞培养技术领域。

背景技术

细胞培养技术在生物、医学科学研究中的应用越来越广泛。原代培养是指通过组织块直接长出单层细胞或者用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代细胞可广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株研究等，还可应用于药物筛选、药物代谢和毒理研究等。除此以外，原代培养也是建立各种细胞系(株)必经的阶段。

心肌成纤维细胞约占心肌组织细胞总数的60~70%，是心脏中非心肌细胞的主要组成部分。该细胞通过产生细胞外基质，如胶原蛋白和纤维连接蛋白，构成了心肌细胞的机械框架；另一方面，心肌成纤维细胞还可以产生心室重构过程中所需的金属蛋白酶、各种生长因子和细胞因子。因此，对心肌功能正常运作起着重要作用。临床上，心肌成纤维细胞的增殖参与了高血压左心室肥厚、缺血性心脏病、扩张型心肌病及充血性心力衰竭等多种心血管疾病的病理过程，研究心肌成纤维细胞对于现代心血管疾病的研究具有重要意义。

迄今为止，研究人类心脏肥大等心脏疾病使用的细胞模型主要为乳鼠的心肌成纤维细胞和乳鼠心肌细胞。但是，因猪与人的亲缘性更近，并且猪的心脏在解剖结构、心脏血管分布、心脏与体重比等方面和人的心脏很相似，因此，如果以猪心肌成纤维细胞作为研究人类心脏肥大等疾病的细胞模型更具优势。然而到目前为止，尚无有关仔猪心肌成纤维细胞分离培养的研究。

发明内容

本发明提供一种仔猪成纤维细胞分离培养方法，该培养方法简单易操作，节约时间，成功率高，获得的原代细胞形态稳定、活性好、数量足，细胞增殖能力强。

本发明的技术方案如下：

一种仔猪心肌成纤维细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将出生1~3日内的仔猪，用0.1%新洁尔灭全身消毒，前腔静脉放血迅速处死，固定仔猪，75%酒精消毒胸腹部皮肤。

(2)无菌手术刀将仔猪胸部皮肤切开。

(3)无菌剪刀沿胸腔最后一根肋骨向前剪开，暴露心脏，立即放入盛有50mL预冷PBS烧杯中，洗去血细胞和血凝块。

(4)无菌镊子将心脏转移到无菌的平皿中，无菌眼科剪截取心室，剥除心包膜，加入适量预冷PBS冲洗，剔除血管、脂肪和结缔组织，预冷PBS漂洗2～3次。

(5)将其剪成1～2mm³组织块，转移到50mL离心管中，用预冷PBS漂洗组织碎块2～3次，以去除血细胞，弃掉洗涤液留下组织块以备消化。

(6)加入0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶1：1混合酶液，用量是组织块体积的3~5倍，置37℃水浴中振荡消化15min后，弃去上清液(主要为红细胞、细胞碎屑及死细胞)。

(7)再加入含DNA酶（终浓度为0.02mg/mL）的混合酶液，置37℃水浴中振荡消化8~10min。

(8)移液管小心吸取上清液移入另一支无菌离心管中，并加入10~15mL含10～15%胎牛血清的DMEM高糖培养液终止消化。如此重复消化3~8次。

(9)细胞悬液用100μm和40μm滤筛分别过滤后收集到离心管，1000RPM/min离心5~6min，弃上清，加入红细胞裂解液3~5mL离心弃上清，用含10%~15%胎牛血清的DMEM高糖培养液重悬细胞，将细胞悬液加入25cm²培养瓶中于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

(10)差速贴壁。从培养瓶放入培养箱中开始计时，60~90min后，弃去未贴壁细胞，贴壁细胞即为分离纯化的心肌成纤维细胞。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

（1）猪的心脏在解剖结构、心脏血管分布、心脏与体重比等方面和人的心脏很相似，是小鼠等实验动物的心脏不能比拟的。为提供稳定、重复性好、与临床更为接近的动物模型，我们选用与人心脏接近的猪作为研究对象。到目前为止，尚无分离猪心肌成纤维细胞的相关报道，用猪心肌成纤维细胞作为人类心脏肥大等疾病的研究模型更加准确。

(2)本发明操作简单易行，无需特殊设备，节约时间等优点，得到仔猪心肌成纤维细胞形态稳定、活性好、数量多，细胞增殖能力强，可用于后续细胞药物敏感试验、细胞的分选与鉴定等研究。