[发明专利]一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法

权利要求书

1.一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于由以下步骤组成：

（1）将养好的待检细胞裂解提取端粒酶，并与端粒酶底物一起加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中，30～37℃孵育0.5～2小时，得到待检液体系，其中所述端粒酶底物序列为：AAT CCG TCG AGC AGA GTT；

（2）将发夹DNA探针H1、发夹DNA探针H2以及单链A-DNA和单链T-DNA分别用浓度为50mmol/L、pH=7.4且含5 mmol/L MgCl₂的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液稀释成浓度为20μmol/L的H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液，其中所述发夹DNA探针H1序列为5’-GGGATGGGTTAGGGCGGGAATCAGAGGGCGGGATGGGGATTCCCGCCCTAACCCTAACTC-3’，发夹DNA探针H2序列为5’-GGGTTGGGCGGGATGGGGATTAGGGTTAGGGCGGGAATCCCCATCCCGCCCTCTGA-3’，单链A-DNA序列为5’-AACCCTAACCCTAACCCTAACTCTGCTC-3’，单链T-DNA序列为5’-GAGTTAGGGTTAGGGCGGGAATC；

（3）将步骤（2）配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液；

（4）向浓度为50 mmol/L、pH=7.4且含5 mmol/L MgCl₂和5 mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤（2）H1溶液、H2溶液和步骤（3）制得的AT-DNA溶液，使最终混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150 nmol/L、200nmol/L、50 nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的 N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ在体系中的浓度为1μmol/L，按照常规方法测定基底荧光信号值I₀；

（5）向与步骤（4）等量的浓度为50 mmol/L、pH=7.4且含5 mmol/L MgCl₂和5 mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入步骤（1）所配制的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤（2）的H1溶液、H2溶液以及步骤（3）制得的AT-DNA溶液，使最终的混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150 nmol/L、200 nmol/L、50 nmol/L，37℃孵育30～60分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的 N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至体系中N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ的浓度达到1μmol/L，按照常规方法测定其荧光信号值I₁；

（6）将步骤（5）的荧光信号值I₁与步骤（4）的基底荧光信号值I₀进行比较，若I₀＜I₁，则待检细胞中的端粒酶有活性；否则，待检细胞中的端粒酶无活性，从而完成待检细胞中端粒酶的检测。

2.根据权利要求1所述的基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于：所述步骤（2）配制的H1溶液和H2溶液以及步骤（3）的AT-DNA溶液分别加热到80～95℃保持5～10min，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。

3.根据权利要求1所述的基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于：所述步骤（4）的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量与步骤（1）的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液的添加量相等。

4.根据权利要求3所述的基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于：所述步骤（4）中端粒酶重复序列扩增缓冲溶液与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积比为1:3.8～4.2。

5.根据权利要求1所述的基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于：所述待检液的添加量与步骤（4）的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量相等。