[发明专利]一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法

说明书

本发明涉及一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，其是通过将端粒酶延长产物与辅助DNA结合释放出引发DNA，引发DNA能够引发链替代反应，形成发夹H1:H2复合物，在复合物的两个末端能够各自形成G‑四链体，N‑甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)自身荧光信号很弱，嵌插G‑四链体后荧光信号显著增强，通过检测NMM荧光信号的变化，可灵敏的检测端粒酶活性，本发明充分利用链替代反应，无需酶辅助就能够实现信号放大，同时巧妙利用了G‑四链体的形成，构建了无需标记，就能灵敏的检测端粒酶活性的方法，为肿瘤疾病的诊断，治疗，以及关于疾病机理研究提供了新思路，在基于端粒酶的癌症治疗诊断方面有很重要的意义。

技术领域

本发明属于肿瘤活性检测技术领域，具体涉及一种基于链替代辅助三重放大技术实现简单、快速、低成本检测癌细胞中端粒酶活性的方法。

背景技术

端粒是真核细胞染色体末端含有的“帽状”结构，它能防止染色体发生降解、端-端融合、重组和染色体丢失，从而保护染色体末端的稳定。在正常情况下，由于染色体存在的末端复制问题，细胞每分裂1次，端粒就丢失50～150个碱基对。随着细胞分裂次数的增加，端粒DNA末端缩短，当缩短到一定程度时，细胞进入危险期，最终导致细胞死亡。端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶，主要由RNA模板(hTR)催化亚基(hTERT)和端粒酶相关蛋白(hTEP)组成。人类端粒酶能够以自身的RNA为模板，在染色体3’末端合成TTAGGG端粒重复序列，以保持染色体末端端粒长度稳定，从而使细胞永生化。研究发现，在85％以上的癌症细胞中，端粒酶活性高度表达，而在正常体细胞中几乎没有表达。(Shay J.W.,WrightW.E.Telomerase therapeutics for cancer:challenges and new directions[J].Nat.Rev.Drug Discov.2006,5:577–584.)。

因此端粒酶已经被作为一种广谱性癌症标识物，在癌症的早期诊断，疾病预知以及癌症病理学研究方面有很重要的作用。(Piatyszek,M.；Kim,N.；Weinrich,S.；Hiyama,K.；Hiyama,E.Wright,W.；Shay,J.Detection of telomerase activity in human cellsand tumors by a telomeric repeat amplification protocol(TRAP)[J].Methods CellSci.1995,17:1-15.)。发展简便、快速、可靠，灵敏的端粒酶活性检测的方法在基于端粒酶的癌症治疗诊断方面有很重要的意义。

在已报道的端粒酶活性检测的方法中经典的方法是基于聚合酶链式反应(PCR)的端粒重复序列扩增法(TRAP)。但是该方法需要先将端粒酶延长产物通过在引物和反向引物混合核苷酸以及热启动聚合酶存在时利用聚合酶链式反应通过一系列循环进行扩增，使目标物的浓度增大，然后再利用聚丙稀酰胺凝胶电泳和染色方法分析结果，操作过程繁琐复杂，条件摸索困难，费时费力，同时需要用到多种试剂，这些都很容易使实验结果中出现假性信号，导致实验结果不是很可靠。为了克服这些缺点，许多研究工作者试图发展无需PCR辅助，同时能够灵敏检测端粒酶活性的检测技术。已报道的无需PCR辅助的端粒酶活性检测的方法中，有基于纳米粒子和酶辅助的信号放大技术，但是纳米粒子合成复杂成本高，而酶需要复杂的操控技术，这都限制了这些技术的广泛应用。而其他一些技术例如表面等离子体共振(SPR)、等需要昂贵复杂的仪器，也限制了它们的广泛应用。为了克服这些缺点，不少研究者试图发展不同的检测途径，其中荧光光谱分析方法由于自身的高灵敏性检测，低成本，操作简单，简单的信号输出也被广泛应用于分析检测中。但是目前已经建立的方法中利用蛋白酶进行信号放大不仅操作复杂，而且使实验成本增加，同时对探针的预标记不仅操作复杂而且昂贵，这些都增加了工作的成本和复杂性。

此外，N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)是一种荧光染料，对G-四链体有高度选择性，其本身的荧光信号很弱，嵌插G-四链体后能产生明显的荧光信号，而且与单链，双链或者三链的作用很弱。