[发明专利]一种高效安全的转座子整合系统及其用途

说明书

本发明属于分子生物学领域，涉及一种高效安全的转座子整合系统及其用途。本发明还涉及一种核酸构建体及其用途。具体地，所述的核酸构建体，其依次包含如下元件：转座子5’末端重复序列、多克隆插入位点、polyA加尾信号序列、转座子3’末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶表达的启动子；其中，所述多克隆插入位点用于可操作地插入外源基因编码序列以及可选的控制外源基因表达的启动子；所述polyA加尾信号序列正反向均具有polyA加尾信号功能；所述转座酶的表达框的方向与外源基因表达框的方向相反。所述核酸构建体能够用于介导外源基因在宿主细胞内高效安全表达。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种高效安全的转座子整合系统及其用途。本发明还涉及一种核酸构建体及其用途。所述核酸构建体能够用于介导外源基因在宿主细胞内高效整合，并高效稳定表达，且整合位点主要集中在宿主细胞基因组内的3个基因间区段，能较大程度上避免随机插入引发的风险。本发明还涉及含有该核酸构建体的重组载体和重组宿主细胞。

背景技术

外源基因在宿主细胞内的表达形式可分为瞬时表达与稳定表达，其中稳定表达是指：(1)外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。重组基因的稳定表达水平一般要比短暂表达低1～2个数量级。(2)宿主细胞虽经过多次传代或条件变化，但表达水平仍然保持稳定。

鉴于稳定表达能随着细胞分裂维持外源基因长时间持续表达，在离体细胞修饰(ex vivo)，如转基因嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)治疗研究中具有重要意义。CAR-T细胞能特异识别并高效杀伤表达特定细胞表面抗原的肿瘤细胞，已取得显著的临床疗效。如针对CD19的CAR-T能高效杀伤表达CD19表面抗原的B细胞淋巴瘤，对晚期难治性B细胞淋巴瘤患者，有效缓解率达到90％(Maude SL,Frey N,Shaw PA,Aplenc R,Barrett DM,Bunin NJ,Chew A,Gonzalez VE,Zheng Z,Lacey SF,Mahnke YD,Melenhorst JJ,Rheingold SR,Shen A,Teachey DT,Levine BL,June CH,Porter DL,Grupp SA.Chimeric antigen receptor T cells forsustained remissions in leukemia.N Engl J Med.2014；371(16):1507-17)。

为实现外源基因在宿主细胞内的稳定表达，常用的载体系统包括：1.逆转录病毒系统：能有效感染宿主细胞，并介导外源基因表达框的基因组高效整合，但其装载容量有限，且重组病毒颗粒制备工艺复杂。2.真核表达质粒系统：制备工艺相对简单，但其通过随机DNA重组的方式插入宿主基因组，整合效率极低。3.转座子系统：采用质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，整合效率相对较低。

最早应用的哺乳动物转座子系统是源于鱼类的“睡美人”转座子(SleepingBeauty)，但是“睡美人”转座子存在过量抑制效应和携带片段偏小(5kb左右)等缺陷，使其在转基因应用上受到限制。来源于鳞翅目昆虫的piggyBac(PB)转座子是目前哺乳动物中活性最高的转座子。其宿主范围极其广泛，从单细胞生物到哺乳动物都能够发挥作用；能够携带较大的外源DNA片段，当转座片段在14kb以内时，转座效率不会显著下降。PB转座子主要采取“cut-paste”机制发生转座，在转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)，基因组可以实现切除后精确修复，在可逆转基因的应用中具有重要作用。此外，PB转座酶可塑性高，通过与其它功能蛋白融合或改变转座酶的功能区域，不仅能够改变转座酶的活性和作用方式，也可以提高外源基因转座的靶向性。近年来，通过密码子优化、特定位点氨基酸定点突变、相应核定位标签的引入等，使PB在哺乳动物细胞内的整合效率进一步提高，使得该系统在基因组研究、基因治疗、细胞治疗、干细胞诱导和诱导后分化等领域获得了广泛的应用。