[发明专利]一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法

权利要求书

1.含有CRISPR-Cas系统的原核生物在内源编辑原核生物基因组中的应用；

所述的原核生物为含有内源I型或III型CRISPR-Cas系统，或同时含有内源I型和III型CRISPR-Cas系统的细菌或古菌；

其应用方法包括：

1)构建基因组编辑质粒：

在原核生物基因组上拟编辑区域选取一段序列作为protospacer即靶标位点，根据protospacer设计两条反向互补的引物，其序列分别为正向引物：5’-AAAG-N_n-3’，反向引物：5’-TAGC-N’_n-3’，其中N_n和N’_n为反向互补序列，N和N’表示碱基A、T、G或C，n表示protospacer的碱基个数；将上述两条引物退火形成具有粘性末端的双链DNA，即spacer片段；人工CRISPR载体pSe-Rp经过限制性内切酶BspMI酶切处理，然后与具有粘性末端的spacer片段酶连，得到能产生成熟的crRNA的人工CRISPR质粒；再将包含突变序列和与宿主细胞基因组上靶标位点两端同源的供体DNA片段插入到上述人工CRISPR质粒上，得到基因组编辑质粒；

2)突变株的获得：基因组编辑质粒电转入原核生物感受态细胞，质粒上的人工CRISPR簇转录出pre-crRNA，pre-crRNA在细胞内被加工成成熟的crRNA；crRNA与细胞内源的CRISPR-Cas蛋白形成crRNP复合体，通过crRNA与宿主细胞基因组上的目标DNA链配对来识别靶标位点进行切割；质粒上的供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，进而得到基因组编辑突变株。