[发明专利]一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法

说明书

本发明一种利用内源CRISPR‑Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法。在对含有内源CRISPR‑Cas系统的原核生物进行基因组编辑时，只需构建一个同时携带人工CRISPR簇和供体DNA的编辑质粒，在内源CRISPR系统对基因组发生DNA干涉后通过同源重组达到对基因组的编辑。其最大的优点在于：应用宿主范围广，所有含有内源CRISPR‑Cas系统的细菌和古菌均可操作；可用于多种编辑方式，缺失、插入和点突变等均可操作；更高的编辑效率，筛选阳性率高，背景低；流程简单，时间周期短，大大减轻原核生物基因组编辑的工作量。

技术领域

本发明属于基因组学及基因工程和生物技术领域，具体涉及到一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法。

背景技术

CRISPR-Cas系统作为一种原核生物抵御病毒等外源入侵核酸的获得性免疫系统，广泛存在于大约90％的古菌和40％细菌中(Van der Oost J et al.,2014；Barrangou Ret al.,2014)。CRISPR-Cas系统被划分为三个主要类型：I型，II型和III型；它们分别有一个标志性蛋白：Cas3，Cas9和Cas10(Makarova KS et al.,2011)。II型CRISPR系统仅需要Cas9一个蛋白与一条crRNA和trans-acting RNA行使DNA干涉活性(Deltcheva E et al.,2011；Gasiunas G et al.,2012)。简单的II型CRISPR系统因此被开发成真核生物基因组编辑工具(Jinek M et al.,2012；Wang H et al.,2013)，并广泛应用于不同的真核生物和细菌(Doudna JA et al.,2014；Sander JD et al.,2014；Hsu PD et al.,2014；Selle K etal.,2015)。

在过去的十年中，各个实验室在一些古菌模式种里建立起了有效的遗传操作体系和工具(Leigh JA et al.,2011)。尽管如此，古菌的遗传学研究因其独特的生长条件，生长缓慢以及对大多数抗生素不敏感等因素而仍然显得非常具有挑战性的(Valentine DL etal.,2007)。因此，居于CRISPR系统的基因组编辑方法在古菌中的应用仍然有待研究和开发。

目前基于CRISPR系统的基因组编辑工作所利用的均是II型CRISPR系统即CRISPR/Cas9体系，而CRISPR/Cas9系统也存在诸多局限性。首先，CRISPR/Cas9可能存在脱靶效应，已经有研究发现Cas9蛋白可能会容许crRNA与靶标序列之间存在一定程度的错配，而这些错配出现的数量和位置必然会影响到基因编辑的特异性。其次，利用外源的CRISPR/Cas9系统，需要对Cas9蛋白进行适用于宿主细胞的优化改造，并需同时在细胞内表达Cas9蛋白和sgRNA(向导RNA)才能发挥作用，使用程序比较复杂。另外，在一些生长条件极端的生物中，胞内环境可能会影响到Cas9蛋白的活性，从而限制了CRISPR/Cas9系统的应用。

本发明针对以上问题，我们提出了利用原核生物自身的CRISPR系统做基因组编辑。该方法同时利用了CRISPR系统的DNA干涉活性和同源重组，因此极大程度上避免了脱靶效应，增强了编辑特异性。该方法只需要构建一个同时携带人工CRISPR簇和供体DNA的编辑质粒，流程简单，操作周期短。该方法利用的是原核生物自身的CRISPR系统，所有含有内源CRISPR-Cas系统的细菌和古菌均适用。