[发明专利]一种对miRNA进行多重定量检测的方法

权利要求书

1.一种对miRNA进行多重定量检测的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)以待测miRNA为模板，以逆转录引物进行逆转录，从而获得逆转录产物；所述逆转录引物的5’端序列为通用序列1，3’端序列为与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列；

(2)以(1)获得的逆转录产物为模板，以互补引物进行单链互补延伸，从而获得单链互补延伸产物；所述互补引物的5’端为通用序列2，3’端为与目标miRNA的5’端序列相应的序列；

(3)以S1核酸酶处理(2)获得的单链互补延伸产物，从而去除单链核酸；

(4)对S1核酸酶处理后的体系进行固相吸附提取，从而获得纯化的双链DNA分子；

(5)以上游通用引物和下游通用引物以及目标miRNA特异性探针对经过(4)处理的体系进行PCR荧光定量检测，从而确定miRNA的量；所述的上游通用引物和下游通用引物的序列具有与通用序列2和通用序列1的序列相应或互补的序列；所述的目标miRNA特异性探针具有目标miRNA或其片段的同义或反义序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标miRNA为1-6种，较佳地为2-4种；相应地，所述的逆转录引物的种类同目标miRNA种类，所述的互补引物的种类同目标miRNA种类；所述的目标miRNA特异性探针的种类同目标miRNA种类。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的通用序列1和通用序列2序列不变。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的通用序列1的长度为10～40个碱基；较佳地为15～30个碱基。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列的长度为8～14个碱基；较佳地为10～12个碱基。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的通用序列2的长度为10～40个碱基；较佳地为15～30个碱基。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的与目标miRNA的5’端序列相应的序列的长度为8～14个碱基；较佳地为10～12个碱基。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，逆转录引物的浓度高于10nM；较佳地为10-500nM，如20nM，50nM，100nM，150nM，200nM，300nM或400nM。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，互补引物的浓度高于10nM；较佳地为10-500nM，如20nM，50nM，100nM，150nM，200nM，300nM或400nM。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，只进行1次变性-退火延伸的过程以避免非特异性延伸。