[发明专利]一种对miRNA进行多重定量检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于荧光定量PCR技术领域，涉及一种可同时定量检测两种或两种以上miRNA的荧光定量PCR方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一组具有基因表达调控功能的长度约20～25个核苷酸的非编码RNA。大量研究表明miRNA参与了各种疾病(如：肿瘤、自身免疫性疾病等)的发生、发展，同时miRNA的表达变化也可被用来筛查、诊断疾病或者对疾病进行预后判断。建立稳定精确的miRNA定量检测方法是其作为生物标记物并用于临床诊断的前提。由于受个体差异性与生物样本多样性的双重影响，单一的miRNA表达变化通常难以精确预测疾病，而必须依赖于多个miRNA组合的表达(表达谱)变化对疾病进行预测。该情况为miRNA的定量检测方法提出了更高要求，即应当建立miRNA的多重定量检测方法。此外，miRNA定量检测的内参标准化也提出了建立双重或多重检测miRNA的方法需求。

茎环引物RT-PCR(Stem-loopRT-PCR)法是目前检测单个miRNA最精准的方法，也是目前其它类miRNA检测方法参照的标准。该方法采用特殊设计的茎环引物对特定miRNA进行逆转录，然后再采用特殊设计的上下游引物及探针对miRNA进行荧光定量检测。该方法能够对10个以下的拷贝进行检测，是检测灵敏度最高的miRNA检测方法。然而该方法最大缺陷是几乎难以实现多重检测，也很难对其实现稳定的标准化控制。该缺陷是限制其进入临床使用的最大障碍。

基因芯片法是检测miRNA的另一种常用方法，该方法是基于固相介质通过固定探针实现对miRNA进行多重检测的方法。通量高是该方法的最大特点，但其敏感性与检测结果的可重复性很低又是其最大缺点，从而该方法也难以进入临床使用。

因此，本领域需要进一步开发既能保证检测灵敏度又能保证一定通量的miRNA检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可同时定量检测两种或两种以上miRNA的荧光定量PCR方法。

在本发明的第一方面，提供一种对miRNA进行多重定量检测的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)以待测miRNA为模板，以逆转录引物进行逆转录，从而获得逆转录产物；所述逆转录引物的5’端序列为通用序列1，3’端序列为与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列；

(2)以(1)获得的逆转录产物为模板，以互补引物进行单链互补延伸，从而获得单链互补延伸产物；所述互补引物的5’端为通用序列2，3’端为与目标miRNA的5’端序列相应的序列；

(3)以S1核酸酶处理(2)获得的单链互补延伸产物，从而去除单链核酸；

(4)对S1核酸酶处理后的体系进行固相吸附提取，从而获得纯化的双链DNA分子；

(5)以上游通用引物和下游通用引物以及目标miRNA特异性探针对经过(4)处理的体系进行PCR荧光定量检测，从而确定miRNA的量；所述的上游通用引物和下游通用引物的序列具有与通用序列2和通用序列1的序列相应(同义或反义)或互补的序列；所述的目标miRNA特异性探针具有目标miRNA或其片段的同义或反义序列。

在一个优选例中，所述的目标miRNA为1-6种，较佳地为2-4种；相应地，所述的逆转录引物的种类同目标miRNA种类(即每一目标miRNA对应一种如步骤(1)设计的逆转录引物)，所述的互补引物的种类同目标miRNA种类(即每一目标miRNA对应一种如步骤(2)设计的互补引物)；所述的目标miRNA特异性探针的种类同目标miRNA种类(即每一目标miRNA对应一种如步骤(5)设计的特异性探针)。

在另一优选例中，所述的通用序列1和通用序列2序列不变。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的通用序列1的长度为10～40个碱基；较佳地为15～30个碱基。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列的长度为8～14个碱基；较佳地为10～12个碱基。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的通用序列2的长度为10～40个碱基；较佳地为15～30个碱基。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的与目标miRNA的5’端序列相应的序列的长度为8～14个碱基；较佳地为10～12个碱基。

在另一优选例中，所述的“与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列”和“与目标miRNA的5’端序列相应的序列”两者相加的碱基数等于或适当小于该目标miRNA的碱基数。