[发明专利]一种食用菌菌丝快速PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于快速PCR领域，特别涉及一种食用菌菌丝快速PCR方法。

背景技术

聚合酶链式反应简称PCR反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，在分子生物学中有广泛的应用。

通常PCR反应之前首先需要提取基因组DNA作为扩增模板，食用菌菌丝基因组DNA提取方法常用CTAB法，需要的菌丝量大，耗时。尽管近年来不断有公司开发出快速PCR试剂盒，但主要针对植物和动物样品，用于食用菌菌丝直接扩增时，经常出现扩增不出特异性条带或对照也扩出条带等问题，无法应用于食用菌菌丝快速PCR扩增。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种食用菌菌丝快速PCR方法，该方法所需菌丝量少，无需耗时进行基因组DNA提取，具有操作简便，检测时间短，准确性高，稳定性和重复性好的优点；可以利用少量菌丝进行PCR扩增，获得所需的目的DNA片段，缩短试验进程，适用于大批量样品的PCR扩增。

本发明的一种食用菌菌丝快速PCR方法，包括：

(1)用移液器吸取裂解液置于PCR管中，用灭菌牙签挑取预先培养的食用菌菌丝置于裂解液中离心，振荡，再离心；

(2)以上述得到的菌丝裂解液为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：12.5μL扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各0.5μL，菌丝裂解液0.5μL，ddH₂O11μL；PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，(引物Tm值-5)℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；

(3)取上述PCR扩增产物与加样缓冲液混匀，点样于琼脂糖凝胶上，于缓冲液中电泳，电泳结束后，用EB染色，然后拍照，即可。

所述步骤(1)中的裂解液占PCR管体积的1/10。

所述步骤(3)中的PCR扩增产物与加样缓冲液的体积比为5:1。

所述步骤(3)中的琼脂糖凝胶浓度为1.5％。

所述步骤(3)中的电泳电压为5V/cm。

本发明不需要提取食用菌基因组DNA，筛选获得裂解液简单快速处理少量菌丝样品作为模板，利用筛选获得的PCR扩增试剂盒即可进行PCR扩增反应，获得所需的目的DNA片段。

有益效果

本发明所需菌丝量少，无需耗时进行基因组DNA提取，具有操作简便，检测时间短，准确性高，稳定性和重复性好的优点；可以利用少量菌丝进行PCR扩增，获得所需的目的DNA片段，缩短试验进程，适用于大批量样品的PCR扩增。

附图说明

图1为草菇菌株交配型基因特异条带扩增图；其中，M为Marker；1为草菇菌株V23；2为对照。

图2为香菇菌株微管蛋白基因特异条带扩增图；其中，M为Marker；1为香菇菌株135；2为对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)菌丝培养：

草菇菌株V23接种PDA试管，适宜温度培养。

(2)PCR反应模板制备：

移液器吸取50μL裂解液置于0.5mLPCR管中，用灭菌竹制牙签挑取少量菌丝置于裂解液中，短暂离心，混匀器上振荡1分钟，短暂离心，以该裂解液为模板。

(3)PCR反应体系及条件

扩增反应体系(25μL)：12.5扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各0.5μL，菌丝裂解液0.5μL，ddH₂O11μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃30second，55℃30second，72℃1min，35个循环；72℃10min。

(4)电泳检测

取上述PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于0.5XTBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上拍照。