[发明专利]一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基及应用

权利要求书

1.一种利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)种子液的制备：将保存的毕赤酵母甘油菌种接于含100ml YPD培养基的500ml摇瓶，30℃，250rpm摇床培养19～20h，作为种子液；

(2)分批培养发酵：1L种子液接入含19L发酵培养基的50L发酵罐中，起始培养条件为30℃，pH 5.0，转速300rpm，通气量0.5m³/h，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧20～30％，培养19～21h；

(3)分批甘油补料培养：分批培养结束后，以10ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的50％甘油5～6h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％；

(4)甲醇诱导培养：分批甘油补料结束后，诱导温度降为25～28℃，诱导pH调为3.25，以3.6ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的甲醇5～6h后，增大甲醇补料速率为10ml/h/L，直至发酵结束，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％；

(5)取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每3～12小时取发酵液样品一次，3000～12000rpm离心5～10min，测定上清液中人胰岛素原表达量，待表达量增加缓慢或减少时，结束发酵；

所述发酵培养基的配方为：蛋白胨1～20g/L，黄豆粉1～10g/L，85％磷酸13～14ml/L，碳酸钙0.3～0.4g/L，七水硫酸镁7.0～8.0g/L，硫酸铵6～10g/L，氢氧化钾1.5～2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6。

2.根据权利要求1所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：蛋白胨10g/L，黄豆粉5g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.33g/L，七水硫酸镁7.4g/L，硫酸铵8g/L，氢氧化钾2g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。

3.根据权利要求1所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：蛋白胨20g/L，黄豆粉10g/L，85％磷酸14ml/L，碳酸钙0.4g/L，七水硫酸镁7g/L，硫酸铵6g/L，氢氧化钾2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。

4.根据权利要求1-3任一项所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，所述蛋白胨为微生物蛋白胨或酵母蛋白胨。

5.根据权利要求1所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，步骤(4)中诱导温度为25℃。

6.根据权利要求1所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，毕赤酵母以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115作为表达宿主的基因重组菌，所述的发酵为在发酵罐中利用毕赤酵母进行甲醇诱导表达外源蛋白人胰岛素原。