[发明专利]一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基及应用

说明书

本发明涉及一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，该培养基配方为：蛋白胨1～20g/L，黄豆粉1～10g/L，85％磷酸13～14ml/L，碳酸钙0.3～0.4g/L，七水硫酸镁7.0～8.0g/L，硫酸铵6～10g/L，氢氧化钾1.5～2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6；本发明还包括基于上述培养基利用毕赤酵母产人胰岛素原的发酵方法，利用本方法，人胰岛素原表达量可提高43％，并且大幅减少发酵时间24～42小时，获得了比常规方法更高的产率。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体而言，本发明涉及一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基以及利用该培养基生产人胰岛素原的方法。

背景技术

胰岛素是最为有效的糖尿病治疗药物，生产人胰岛素的方法分为化学合成法和基因重组法，基因重组法先生产人胰岛素原，再进行后续工艺转变为人胰岛素或人胰岛素类似物。基因重组法主要使用两种方法生产人胰岛素原，一种方法使用原核生物大肠杆菌，另一种方法使用真核生物酿酒酵母。

毕赤酵母既具有类似原核生物大肠杆菌的繁殖快、易培养、便于遗传操作的特性，又具有真核生物酿酒酵母的蛋白可翻译后修饰、蛋白正确折叠的特性，应用十分广泛，毕赤酵母已成为多种蛋白的理想表达体系(Lin Cereghino GP,Lin Cereghino J,Ilgen C,Cregg J M(2002)Production of recombinant proteins in fermenter cultures oftheyeast Pichia pastoris.Curr Opin Biotechnol 13:329–332)。

在毕赤酵母表达外源蛋白需要利用培养基中的营养成分，培养基除了必须含有菌体生长代谢所必需的物质和元素外，还必须含有构成外源蛋白所需要的物质和元素，如，碳源、氮源、无机盐等；碳源对酵母生长代谢的作用主要是提供细胞及产物的碳骨架，提供细胞生命活动所需的能量，碳源可以分为无机碳源物质和有机碳源物质，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素等糖类，还包括有机酸，氨基酸，醇类，醛，酚等含碳化合物；毕赤酵母常利用的碳源一般为甘油、葡萄糖、甲醇等。氮源为酵母细胞提供构成蛋白质、核酸及其他氮元素化合物的材料，氮源可以分为无机氮源和有机氮源，无机氮源包括铵盐、硝酸盐等，有机氮源包括牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、血粉、蝉蛹粉、豆(饼)粉、花生(饼)粉等。