[发明专利]烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包含以下引物：

正向引物：5’-TACCGCATCAAAGAGGGCAG-3’，

反向引物：5’-CTTCTGGGGTGTGCAATCCT-3’。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：还包含：2×荧光定量PCR反应混合液、标准阳性对照样品、DNAMarker、超纯水；所述标准阳性对照样品为包含青枯病菌胞外葡聚糖酶基因片段的DNA。

3.烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测样品DNA为模板，利用正、反向引物进行SYBRGreenI荧光定量PCR扩增；扩增片段为246bp时，将待测样品DNA的CT值代入以青枯病菌拷贝数对数值为X轴、CT值为Y轴制作的标准曲线中，得到PCR反应体系中青枯病菌的拷贝数；将拷贝数代入以下公式计算得到单位质量待测样品中青枯病菌的定殖数量；

C＝Q×(V_DNA/V_PCR)×(1/W_EXT)，

式中：C为单位质量待测样品中青枯病菌的定殖数量；Q为PCR反应体系中青枯病菌的数量；V_DNA/V_PCR为待测样品的稀释倍数，其中V_DNA为待测样品稀释后的总体积，V_PCR为加入PCR反应体系中的稀释后待测样品的体积；W_EXT为待测样品的质量；

所述正、反向引物如下：

正向引物：5’-TACCGCATCAAAGAGGGCAG-3’，

反向引物：5’-CTTCTGGGGTGTGCAATCCT-3’。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述SYBRGreenI荧光定量PCR扩增的反应体系为：2×荧光定量PCR反应混合液12.5μL，待测样品DNA溶液1μL，10μmol/L正/反向引物各1μL，ddH₂O补足至25μL。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述SYBRGreenI荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃热启动，8min预变性；扩增循环：95℃30s，60℃10s，72℃20s，循环45次。

6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述标准曲线的制作方法为：

1)以标准阳性对照样品为模板，利用正、反向引物进行SYBRGreenI荧光定量PCR扩增，得到大小246bp的扩增片段，回收扩增片段并将其插入到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌并筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切鉴定正确后得到重组质粒pMD18T-EG；

2)将重组质粒pMD18T-EG制成逐级稀释液，再利用正、反向引物进行SYBRGreenI荧光定量PCR扩增，记录每级稀释液的CT值，以每级稀释液中青枯病菌拷贝数对数值为X轴、CT值为Y轴制得标准曲线。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述标准阳性对照样品为包含青枯病菌胞外葡聚糖酶基因片段的DNA。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤1)、2)中所述SYBRGreenI荧光定量PCR扩增的反应体系为：2×荧光定量PCR反应混合液12.5μL，标准阳性对照样品或重组质粒pMD18T-EG逐级稀释液1μL，10μmol/L正/反向引物各1μL，ddH₂O补足至25μL。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤1)、2)中所述SYBRGreenI荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃热启动，8min预变性；扩增循环：95℃30s，60℃10s，72℃20s，循环45次。

10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤2)中所述逐级稀释液的制备方法为：将步骤1)中重组质粒pMD18T-EG经紫外分光光度计A260定量，测量值即为质粒母液的质量浓度，用灭菌后的超纯水稀释成若干浓度梯度，即得。