[发明专利]烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，同时还涉及一种烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

烟草青枯病是由青枯假单包杆菌引起的维管束病害，以土壤传播为主，是威胁烟草生产的毁灭性病害之一，一旦发病即可造成全株死亡，对烟草的产量和质量造成极大影响。在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区危害严重，个别年份暴发流行，常与根黑腐病、黑胫病、根结线虫病混合发生。许多烟田发病率达50％以上，在极端气候下发病率可高达80％～90％，造成毁灭性损失，已成为我国烟草生产及其经济效益上的重要制约因素。

烟草青枯病一旦发生，防治难度较大，因此需要在发生前快速、准确地检测潜伏在植烟土壤中青枯病菌的数量，对控制青枯病菌具有重要意义。

目前，对病害的检测方法主要有常规测定法、血清学方法和分子生物学方法等，常规测定法主要是通过选择性培养基来分离病菌病根据形态进行鉴定的方法，其缺点是检测周期长，初学者误判率高。血清学技术检测微生物病原菌准确度较高，但是该技术操作过程较为复杂，灵敏度不高。而荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种高通量、高灵敏度的检测技术，在病原微生物的检测方面应用很广，但目前应用实时荧光定量PCR技术检测R.solanacearum的报道较少。2000年Weller等根据设计特异TaqMan探针，通过实时荧光定量PCR特异检测R.solanacearum；2005年漆艳香等根据香蕉细菌性枯萎病菌(R.solanacearumrace2)16SrDNA序列的高变区，设计引物RsF/RsR和TaqMan探针Rsprobe，用实时荧光PCR对R.solanacearumrace2进行检测，其检测灵敏度为24.6fg/μL悬液。

锁核酸(Lockednucleicacid，LNA)是一种寡核酸衍生物，其结构中β-D-呋喃核糖的2-O,4-C位通过缩水作用形成环形的结构如氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成刚性的缩合结构。LNA的这个环形桥能锁定呋喃糖的N构型，降低核糖结构的柔韧性，增加磷酸盐骨架局部结构的稳定性，具有较强的杂交性和稳定性。在寡核苷酸中加入锁(LNA)修饰碱基可显著增强寡核苷酸与DNA的结合能力。

R.solanacearum是一种严重危害烟草的病原细菌，Realtime-PCR检测技术的研究将为烟草青枯病的预防提供重要依据。但目前的检测方法灵敏度仍然较低，尤其是针对土壤中低拷贝的病菌，需要更加敏感的烟草青枯病检测试剂和检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其能够快速、高敏感度地检测植烟土壤中青枯病菌的数量。

同时，本发明还提供一种烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测方法，其操作过程简单，检测时间短，敏感度高，安全可靠。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其包含以下引物：

正向引物：5’-TACCGCATCAAAGAGGGCAG-3’(如SEQIDNO.1所示)，

反向引物：5’-CTTCTGGGGTGTGCAATCCT-3’(如SEQIDNO.2所示)；

其中，下划线表示LNA修饰位点。

具体的，烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒还可以包含2×荧光定量PCR反应混合液、标准阳性对照样品、DNAMarker、超纯水等。所述标准阳性对照样品为包含青枯病菌胞外葡聚糖酶基因(endoglucanase，缩写EG)片段的DNA。

烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：以待测样品DNA为模板，利用正、反向引物进行SYBRGreenI荧光定量PCR扩增；扩增片段为246bp时，将待测样品DNA的CT值代入以青枯病菌拷贝数对数值为X轴、CT值为Y轴制作的标准曲线中，得到PCR反应体系中青枯病菌的拷贝数；将拷贝数代入以下公式计算得到单位质量待测样品中青枯病菌的定殖数量；

C＝Q×(V_DNA/V_PCR)×(1/W_EXT)，