[发明专利]重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

权利要求书

1.一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，其步骤为：（1）将阳离子离子层析柱用平衡液进行平衡；（2）将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清上平衡后的阳离子离子层析柱，依次用平衡液进行平衡、用洗涤液进行洗涤和用洗脱液进行洗脱；收集洗脱产物，得到纯化的重组人胰岛素前体；（3）将纯化的重组人胰岛素前体用胰蛋白酶进行酶切转换，得到缺少B链第30位苏氨酸的人胰岛素；其特征在于：所述洗脱液为碳酸氢铵缓冲液、硼酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的任意一种；所述洗脱液的浓度为0.05-0.3 mol/L；所述洗脱液的pH值为7.8-8.5；

步骤（1）或步骤（2）中所述的平衡液由缓冲液和无机盐组成；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠；所述缓冲液的浓度为0.01-0.2mol/L；所述无机盐的浓度为0.01-0.12mol/L；所述平衡液的pH值为2.0-4.5；

步骤（2）中所述洗涤为用洗涤液A进行洗涤；用洗涤液A洗涤后，再接着用洗涤液B洗涤阳离子层析柱；所述洗涤液A由缓冲液和无机盐组成；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠；其中，所述缓冲液的浓度为0.01-0.2mol/L，所述无机盐的浓度为0.01-0.2mol/L；其中，所述洗涤液B为1-5mmol/L盐酸；所述洗涤液A或洗涤液B的pH值为2.0-4.5。

2.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗脱液的pH值为8.0-8.5。

3.按照权利要求1或2所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗脱液的浓度为0.1-0.15 mol/L。

4.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液A中缓冲液浓度为0.01-0.05mol/L；所述洗涤液A中无机盐浓度为0.01-0.12mol/L。

5.按照权利要求4所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液A中缓冲液浓度为20mmol/L；所述洗涤液A中无机盐浓度为0.1 mol/L。

6.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液B为5mmol/L盐酸。

7.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液A或洗涤液B的pH值为3.0-4.0。

8.按照权利要求7所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液A或洗涤液B的pH值为3.5-4.0。

9.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：步骤（1）或步骤（2）中所述的平衡液中的缓冲液浓度为0.01-0.05mol/L ； 所述无机盐的浓度为0.01-0.1mol/L；

所述平衡液的pH值为3.0-4.0；

步骤（3）中胰蛋白酶的加入量为：按照质量比计，胰蛋白酶：重组人胰岛素前体=1:100-1:400；

所述酶切的温度为20-40℃；酶切的时间为0.5-3小时。

10.按照权利要求9所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述缓冲液浓度为20mmol/L；所述无机盐的浓度为0.01mol/L，所述平衡液的pH值为3.5-4.0；

步骤（3）中胰蛋白酶的加入量为：胰蛋白酶：重组人胰岛素前体= 1:200；

所述酶切的温度为25-30℃；酶切的时间为1-1.5小时。

11.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述阳离子离子层析柱的离子交换填料为S Sepharose FF、SP Sepharose FF、CM Sepharose FF，Source 15 S或Source 30 S中的任意一种；所述阳离子离子层析柱的温度为20-25℃；所述洗涤液或洗脱液的线性流速为7.5-30mm/min。