[发明专利]重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

说明书

本发明公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，属于重组人胰岛素及其类似物的制备领域。本发明将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清用阳离子层析柱进行纯化，在层析的洗涤时先后采用两种不同洗涤液进行洗涤，更快速的进行目的蛋白的洗脱，缩短洗脱时间，减少目的蛋白沉淀，同时减少洗脱样品体积；在洗脱时采用pH值7.0‑9.0的洗脱液进行洗脱，洗脱后的产物不需进行换相操作，直接加入胰蛋白酶进行酶切转换，转换效率高。本发明方法操作简单，经过一步离子层析纯化完成对发酵液上清的粗纯化和换相操作，能够将样品纯度从14％提高至95％，且纯化后的样品直接进行酶切，酶切转换效率在95％以上，简化生产工艺，节约成本。

技术领域

本发明涉及一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，属于重组人胰岛素的制备领域。

背景技术

糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，中国糖尿病患病人数已取代印度成为世界第一，世界卫生组织(WHO)预测至2025年全球糖尿病人数将突破3.0亿。

胰岛素制品是最有效的糖尿病治疗药物之一。随着科学技术的发展，从提取动物胰岛素到有机合成胰岛素、半合成人胰岛素，到现如今占主要市场的重组人胰岛素，胰岛素的工业化生产过程已经历了翻天覆地的变化。重组胰岛素前体分为包涵体和分泌蛋白两种形式，分泌蛋白常使用阳离子层析柱，但在样品进行离子纯化前需要初步纯化，如中国专利CN1854299A中提到，胰岛素前体在离子层析纯化前需要经过盐析或微滤步骤进行初步纯化，样品处理程序复杂，操作繁琐，且工艺步骤的增多必然会导致样品收率的降低。

因此，开发一种新的重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，使纯化后的重组胰岛素前体直接进行酶切，简化生产工艺，将具有重要的市场价值和应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，该方法经过一步离子层析纯化，能够将重组胰岛素前体纯度从14％提高至95％，且纯化后的样品可直接进行酶切，酶切转换效率在95％以上，简化了生产工艺，节约纯化成本。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，包括：(1)将阳离子离子层析柱用平衡液进行平衡；(2)将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清上平衡后的阳离子离子层析柱，依次用平衡液进行平衡、用洗涤液进行洗涤和用洗脱液进行洗脱；收集洗脱产物，得到纯化的重组人胰岛素前体；(3)将纯化的重组人胰岛素前体用胰蛋白酶进行酶切转换，得到缺少B链第30位苏氨酸的人胰岛素；其中，所述洗脱液的pH值为7.0-9.0，优选为7.8-8.5，更优选为8.0-8.5。

其中，所述洗脱液为碳酸氢铵缓冲液、硼酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的任意一种。洗脱液的浓度为0.05-0.3mol/L；优选的，所述洗脱液的浓度为0.1-0.15mol/L。

步骤(2)中所述洗涤过程分为两步，即先用洗涤液A进行洗涤，然后再用洗涤液B进行洗涤；所述洗涤液A包括：缓冲液和无机盐；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠；优选的，所述缓冲液的浓度为0.01-0.2mol/L，优选为0.01-0.05mol/L，最优选为20mmol/L；所述无机盐的浓度为0.01-0.2mol/L，优选为0.01-0.12mol/L，最优选为0.1mol/L。具体的，所述洗涤液A包括：20mmol/L柠檬酸+0.1mol/L NaCl；或者，所述洗涤液A包括：20mmol/L乙酸+0.1mol/L NaCl。

步骤(2)中所述洗涤还包括：用洗涤液A洗涤后，再接着用洗涤液B洗涤阳离子层析柱；所述洗涤液B为盐酸；优选的，所述洗涤液B为1-5mmol/L盐酸；最优选为5mmol/L盐酸。