[发明专利]大熊猫乳汁中关键因子的分析方法

说明书

技术领域

本发明属于大熊猫人工养殖领域，具体涉及一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法。

背景技术

大熊猫育幼成活难曾经是圈养大熊猫“三难”问题之一。综合统计表明，在圈养条件下， 从1963年-1990年的27年里，大熊猫幼仔的成活率(半岁)仅为33.9％。上世纪90年代以 来，由于大熊猫幼仔出生时非常严重的免疫缺陷，科学家认识到对大熊猫幼仔及时补充母兽 初乳的重要性。科学家通过开展大熊猫母兽与人工轮换哺育幼仔以及人工补充初乳的方式， 大熊猫幼仔的成活率已经得到了显著提高。近5年来，幼仔成活率保持在90％以上。尽管已 经意识到初乳对于大熊猫幼仔建立被动免疫的重要性，但是截止到目前为止，大熊猫乳汁尤 其是初乳中对于幼仔免疫力发育至关重要的蛋白成分未能进行有效分析。之前的相关研究主 要集中于测定乳汁中的粗蛋白含量，大熊猫乳汁蛋白的氨基酸序列分析及其功能性研究并未 开展。关于大熊猫乳汁中其它营养成分的分析，之前的研究主要集中于测定乳汁的粗脂肪、 粗灰分、乳糖、矿物元素、维生素等营养物质。由于受到仪器设备及大熊猫乳汁样本数量的 限制，大熊猫在不同泌乳阶段的营养成分分析未能开展研究。

发明内容

本发明目的是提供一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，解决大熊猫乳汁尤其是初乳 中对于幼仔免疫力发育至关重要的蛋白成分未能进行有效分析的问题。

本发明的技术方案为：一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，包括如下步骤：

(1)采集分娩后的大熊猫在不同阶段的乳汁，

(2)通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分因子进行推测鉴定，

(3)将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行分类，

(4)通过OPLS-DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子，并对 这些成分因子进行成分鉴定，

(5)通过OPLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与大熊猫幼仔体 重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有关键作用的因子。

进一步地，步骤(2)中通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分进行推测鉴定的步骤为：

1)将采集的乳汁经降解离心处理后通过LC-MS处理，得到乳汁成分的液相质谱数据；

2)将液相质谱数据与代谢组学数据库对比，筛选得到成分因子LC-HRMS因子。

进一步地，步骤(2)中通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分进行推测鉴定的具体方 法为：

在室温溶解采集的乳汁样品，各取50μl乳汁样品加入体积比为1:1的methanol/acetonitrile 溶液，混合溶液，超声波降解20秒，15000rpm，4℃离心10min，取上清液，将上清液样品 置入Accela600HPLC系统后，系统从HiChrom中吸取10ul各样品溶液注入ZIC-pHILIC柱 中，整个LC-MS分析过程中，样品上机顺序安排为随机，将所得到的数据输出到Excel表中， 消除背景噪音，信号的最大强度必须超过空白对照信号的20倍，否则便被从库中移除，之后 用代谢组学数据库并基于准确分子量推测鉴定到乳汁的成分因子LC-HRMS因子。

进一步地，步骤(3)中将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行分 类的方法为：将经过LC-MS分析后的大熊猫乳汁中的成分因子LC-HRMS因子进行PCA和 HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段分为初乳阶段、后初乳阶段和常乳阶段；初乳阶段为1-6天， 后初乳阶段为6-20天，常乳阶段为20天以上。

进一步地，通过OPLS-DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子， 并对这些成分因子进行成分鉴定的方法为：根据分类结果将乳汁样品在7天前后的代谢产物 分子浓度分别进行准确测定，并进行OPLS-DA分析，筛选出初乳及常乳中信号强及浓度较高 的成分因子LC-HRMS因子，将这些成分因子通过MZMine2.10和标准品或元素组分分析进 行成分鉴定工作。