[发明专利]体外诱导脂肪间充质干细胞向成熟肝细胞分化的方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种体外诱导脂肪来源的间充质干细胞(ADSCs)向成熟肝细胞(iHeps)分化的方法。该方法包括的步骤为：分离出ADSCs；体外诱导培养ADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为3个阶段：内胚层诱导阶段；成肝诱导阶段；肝细胞的成熟阶段。使用本发明的诱导分化方法，只需要九天左右的时间就足够产生具有肝细胞形态，基因表达及功能的肝细胞，是目前用时最短的肝细胞分化方法。这将有利于临床治疗方案的应用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种体外诱导脂肪来源的间充质干细胞(ADSCs)向成熟肝细胞(iHeps)分化的方法。

背景技术

肝脏是一个调节多种生理过程的关键器官。肝脏疾病，如爆发性肝损伤，是导致死亡的重要原因。原位肝移植(OLT)是目前治疗终末期肝脏疾病的唯一方法，但由于免疫排斥等副作用及其肝脏供体的短缺限制了肝移植的临床应用。肝细胞移植是治疗肝功能不全的整体肝移植的替代疗法；虽然原代肝细胞可以从供体肝脏中分离得到，但每次移植需要1～5×10⁹个肝细胞，这就需要获得大量的供体肝或大量体外扩增原代肝细胞。供体肝脏的缺乏和原代肝细胞体外扩增困难等原因使得获得充足的可用于细胞治疗的肝细胞非常困难。为了解决目前这种窘境，迫切需要可快速产生大量肝细胞的新方法。

过去几年，发现了多种可用于治疗肝脏疾病的肝外细胞群，其中具有多向分化潜能和半无限增殖能力的间充质干细胞(MSCs)就是一种重要的具有潜在应用价值的细胞。间充质干细胞可从骨髓、脂肪、脐带血、羊膜液、头皮、胎盘等多种组织中获得。其中，脂肪来源的MSCs(ADSCs)被认为是最有应用前景的一类间充质干细胞，其在脂肪组织的占比介于1：100到1：500之间，远高于骨髓间充质干细胞在骨髓中所占比例，在再生医学中有良好的应用前景。ADSCs来源充足，易得到，创伤小，可取材于患者自身的脂肪组织，这样就避免了免疫排斥反应，也解决了伦理问题等的障碍。已有研究表明ADSCs在体外具有诱导分化成肝细胞的潜力。

目前的技术由ADSCs向肝细胞诱导分化都需要大约1个月的时间，使得这些诱导分化方法并不适用于实际临床应用。而临床应用需要尽可能缩短体外诱导分化的时间。因此，开发新的能在短时间内将ADSCs高效地诱导成为成熟肝细胞(iHeps)的方法是本领域的一个难题。

发明内容

本发明要求解决的技术问题是现有ADSCs诱导成为iHeps的方法耗时长，效率低的缺陷。

本发明解决技术问题的技术方案是提供一种新的体外诱导ADSCs向iHeps分化的方 法。该方法包括以下步骤：

a、从离体脂肪组织中分离出ADSCs；

b、体外诱导ADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为3个阶段：

内胚层诱导阶段：在步骤a分离得到的ADSCs中加入含有50～200nM IDE1和1～5μΜ CHIR99021的RPMI-1640培养基或者含有50～200nM IDE1和1～5μΜ CHIR99021的DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为20～28小时。

成肝诱导阶段：在完成内胚层诱导后的细胞中加入含有50-200nM IDE和10-30ng/mL FGF4的RPMI-1640培养基或者含有50-200nM IDE和10-30ng/mL FGF4的DMEM/F12中培养基诱导培养64～80小时。

肝细胞的成熟阶段：在完成成肝诱导后的细胞中加入肝细胞生长因子(HGF)至100-200ng/mL、加入纤维母细胞生长因子4(FGF4)至10-30ng/mL、加入抑瘤素M(OsM)至20-40ng/mL、加入地塞米松(Dex)至1.5～3×10^-5mol/L以及加入ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中诱导培养，培养时间为112～136小时。