[发明专利]一种纤维素酶高效生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种纤维素酶生产方法。

背景技术

纤维素酶来源广泛、成分复杂，广泛存在于昆虫体、软体动物体以及真菌、细菌与放线菌等微生物的代谢产物中，主要生产途径是微生物发酵，其中以丝状真菌和细菌纤维素酶应用最为广泛，目前主要还是利用真菌来发酵产纤维素酶。

在细菌中大多数好氧细菌和厌氧细菌都富含丰富的纤维素酶系，特别是瘤胃中富含多种纤维素降解酶系的厌氧菌。世界纤维素市场中的纤维素酶有20％来自木霉属和曲霉属。主要是由于丝状真菌具有产酶的诸多优点：①产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；②产酶效率高，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；③同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。纤维素酶是一个复合酶系，酶系由三类功能不同但又互补的酶组成。这三类酶分别是内切葡聚糖酶(EG，Cx酶，又称CMC酶)、外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH，C1酶)和β-葡萄糖苷酶(BGL，纤维二糖酶)；大多数编码纤维素酶的基因是染色体基因。纤维素酶系降解原理目前尚无定论，主要有三种作用机理：协同理论、碎片假说和原初反应假说，其中以协同理论被大部分研究学者和专家所认可，其主要观点为内切葡聚糖这类酶首先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截断，产生大量非还原性末端。然后外切葡聚糖酶逐个切下纤维素的非还原末端水解产生纤维二糖；而β-葡萄糖苷酶则水解纤维二糖生成葡萄糖。三者缺一不可，协同作用，也只有在合适的比例和组成下，才能共同作用快速实现纤维素的完全水解。

纤维素酶发酵过程容易受到碳水阻遏效应(CCR)对酶发酵合成的影响，即在半纤维素和/或纤维素酶合成过程中，往往由于培养基中存在着葡萄糖、木糖等单糖而通过碳水阻遏效应(CCR)抑制了酶的合成。目前常用选育方法消除部分CCR效应，例如，周广麟等人先后研究了去泛素化蛋白酶基因creB缺失及转录调控基因bglR缺失对生产菌株生长状态及形态、纤维素酶活力、纤维素酶性质的影响。creB基因缺失突变株纤维素酶表达分泌抗葡萄糖代谢阻遏效应，菌株的滤纸酶活、内切纤维素酶活、木聚糖酶活以及外切纤维素酶活分别提高1.8倍、1.71倍、2.06倍以及2.04倍，其胞外蛋白质含量提高了2.68倍；而bglR基因为转录调控因子的缺失，β葡萄糖苷酶酶活力得到大幅度提高，提高了40％，但滤纸酶活、内切葡聚糖酶及木聚糖酶活明显降低。现有技术虽然取得了一定成效，但如何解决纤维素酶发酵过程碳水阻遏效应(CCR)、提高纤维素生产能力，仍是本领域技术人员面临的主要问题。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，发明人通过研究发现，草酸青霉发酵生产纤维素酶的过程中，补料、DO、pH等发酵条件与纤维素酶表达量密切相关，通过补料、DO、pH等工艺实现了纤维素的表达量和胞外蛋白的表达量的大幅度增加；进一步的，通过研究发现，补料过程中，菌株的代谢与摄氧率极为相关，通过OUR控制可以解除补料过程的碳阻遏效应，控制OUR维持在一定水平维持菌株正常生长代谢来增强次级产物纤维素酶的产生，可以明显提高生产纤维素酶的FPA、β葡萄糖苷酶活力和蛋白含量。

具体的，本发明提供了以下技术方案：

一种草酸青霉液态发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，控制整个发酵期间pH维持在3.5～6.0之间，发酵中后期至发酵结束期间进行补料培养，期间控制摄氧率(OUR)维持12(±5)～35(±5)mmol/L/h。

本领域技术人员应当明了草酸青霉发酵生产纤维素酶中进入发酵中后期的时间，此时葡萄糖消耗，碳阻遏效应解除，纤维素酶开始合成，优选，发酵24h至发酵结束期间进行补料培养。

优选的，补料培养过程中，OUR与溶氧、补料三者变量关系，溶氧与补料呈协同互补关系，OUR与溶氧具有一定的比例关系，通过更换桨叶，调节搅拌转速保持溶氧在15％以上。

优选的，补料培养期间控制摄氧率(OUR)维持15(±5)～30(±5)mmol/L/h。

优选的，发酵过程pH调节为：发酵开始pH调整为5.5—6.0，0-20hpH逐渐下降，用氨水控制发酵培养基pH3.5以上，50-60h后pH回升至5.5-6.0后，开始用磷酸调节pH至6.0以下；

优选的，发酵过程进行通气量控制，每分钟通气量：发酵体积≥1:1；

优选的，发酵过程调节溶氧，发酵起始溶氧调整至100％，发酵过程中通过调节搅拌转速保持溶氧在15％以上；

优选的，整个发酵过程温度保持28～33℃；