[发明专利]果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括HAV2×RT-PCRmix、NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、MS22×RT-PCRmix、无RNase水、HAV阳性对照、NVGⅠ+GⅡ阳性对照、大肠杆菌噬菌体MS2（2.5×10¹⁰pfu/mL）各一管。

2.根据权利要求1所述的果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒，其特征在于，HAV2×RT-PCRmix、NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、大肠杆菌噬菌体MS22×RT-PCRmix中涉及的检测引物和探针如下：

（1）

甲型肝炎病毒检测引物和探针：

正向引物HAV-F：5’-TCACCGCCGTTYGCCTAG-3’

反向引物HAV-R：5’-GGGGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3’

探针HAV-P：5’-FAM-CCTGAACYYGCAGGAATYAA-MGB-BHQ-3’

（2）

诺如病毒检测引物和探针

诺如病毒GⅠ：

正向引物NVG1-F：5’-CGYTGGATGCGNTTYCAT-3’

反向引物NVG1-R：5’-CCTTAGACGCCATCATCATTYAC-3’

探针NVG1-P：5’-Cy5-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-3’

（3）

诺如病毒检测引物和探针

诺如病毒GⅡ：

正向引物NVG2-F：5’-ATGTTCYGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’

反向引物NVG2-R：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’

探针NVG2-P：5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-BHQ-3’

（4）

大肠杆菌噬菌体MS2检测引物和探针

MS2-TM3-F：5'-GGCTGCTCGCGGATACCC-3

MS2-TM3-R：5'-TGAGGGAATGTGGGAACCG-3

MS2-TM2JOE：5'-JOE-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-NFQ-3'。

3.利用上述任一项权利要求所述的试剂盒检测果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①果蔬样品中病毒的富集

a、取5-10个草莓或25g检测样品，加入bagpage中；加入35mLTGBE缓冲液及30U的果胶酶黑曲霉，同时加入大肠杆菌噬菌体MS2标准样品100μL；在室温下60rpm恒定摇晃孵育20min；

b、收集洗脱液于50mL无菌离心管中，10000×g离心30min，在4℃下离心澄清；将上清液转入50mL无菌离心管中，并用1mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0；

c、加入0.25体积的5×PEG/NaCl溶液（最终浓度为10%PEG，0.3MNaCl），振荡60s以混匀，之后在5℃60rpm孵育60min或者过夜；

d、在5℃10000×g离心30min，弃去上清液，然后在5℃10000×g离心5min，以压实沉淀物，用枪头吸取剩余液体弃掉；

e、加入500μLPBS蜗旋震荡，重悬沉淀，静置5min；于5℃10000×g离心5min；

f、吸取离心管的上清液体置于2mL的无菌离心管中，加入500μL或等体积的氯仿-正丁醇，涡旋混合，然后在室温下孵育5min；

g、于5℃10000×g下离心15min，将上层水相小心地转移到一个新的离心管中，保留用于提取RNA；

②病毒RNA提取

③大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线的建立

取制备好的大肠杆菌噬菌体MS2质控样品，稀释至2.5×10¹⁰pfu/mL，取100μL进行提取病毒RNA，最终稀释于100μL无RNA酶H₂O中；取20μL稀释于180μL无RNA酶H₂O，梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，则病毒浓度分别代表2.5×10⁹、2.5×10⁸、2.5×10⁷、2.5×10⁶、2.5×10⁵、2.5×10⁴pfu/mL，分别进行荧光定量RT-PCR反应，应用Ct值和噬菌体浓度建立回归标准曲线；

④甲型肝炎病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型、大肠杆菌噬菌体MS2检测

将步骤②提取的RNA分别取5μL，按照甲型肝炎病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型、大肠杆菌噬菌体MS2三种目标分别检测，每个检测目标反应体系包括：2×RT-PCRmix12.5μL、样品5μL、水补齐至25μL，每个样品做原倍提取液和10×稀释提取液，同时设置阳性对照和阴性对照；

⑤病毒RNA回收率确定

根据MS2荧光定量RT-PCR反应获得的Ct值和标准曲线回归方程，计算出MS2浓度，除以加样时的病毒浓度，乘以100%即为回收率，即：

回收率（%）=(回收后病毒浓度/加注病毒浓度)×100；

⑥结果判定

检测结果判定必须在阳性对照和阴性对照成立的情况下做如下判定：

根据MS2的回收效率判定结果的有效性；若病毒RNA回收率大于或等于1%测试有效，根据检测情况判定甲型肝炎病毒和诺如病毒GⅠ型和GⅡ型检测结果；若病毒RNA回收率小于1%，则需要重新进行检测。