[发明专利]果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒和检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒和检测方法，属于食品安全、环境监测和食源性病毒检测的技术领域。

背景技术：

果蔬生产在我国进出口贸易中占有重要地位。以草莓为例，我国草莓种植面积约90100公顷，总产达220.6万吨，占世界总产的35.7％，为世界上最大的草莓生产国。国内草莓产地主要分布在山东、安徽、辽宁、河北、江苏等东部沿海地区。冷冻草莓是一个重要的出口农产品，2012年全国共出口冷冻草莓5893批次、数重量155104.97吨、货值20379.16万美元。主要输往荷兰、德国、俄罗斯、日本、英国、韩国、澳大利亚、泰国等70个国家及地区。

2012年9月，德国爆发了历史上最大的一次肠胃炎爆发事件，约11000名患者出现呕吐、腹泻症状，德国怀疑是由中国出口的草莓携带诺如病毒(Norovirus,NoV)所致，并在欧洲食品和饲料安全快速预警系统(RASFF)发布预警(预警号2012.1409)。同期，比利时在我国出口的冷冻草莓中检测到甲型肝炎病毒(HAV)，在RASFF发布预警信息(预警号2012.1534)。果蔬生产的整个从“生产到餐桌”多个相关环节都有可能威胁果蔬产品，有必要对产品质量进行有效的控制。

甲型肝炎病毒、诺如病毒等病毒是多起重大的水源性非细菌性疾病的流行病学事件暴发的元凶。其中，甲型肝炎病毒(HepatitisAVirus,HAV)是一种正链RNA病毒，它属于小RNA病毒科肝病毒属。虽然现在已成功地研制出甲型肝炎疫苗,有效地控制了甲型肝炎的传播和流行,但在人群免疫水平低的地方，人群普遍易感，HAV主要通过粪-口途径污染水或食物，导致甲型肝炎暴发流行。HAV基因组虽然只有一个血清型，但有7基因型，在同一地区可能存在多种HAV基因型的流行。

诺如病毒是杯状病毒科呈二十面体对称球形单股正链RNA病毒，又称为诺罗病毒、诺沃克病毒或脓融病毒，是一种引起非细菌性急性胃肠炎的主要病毒，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播。诺如病毒基因组全长约7.7kb，包含3个开放阅读框(ORFs)，ORF1编码非结构蛋白，包括RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRp)；ORF2和ORF3分别编码主要(VP1)和次要(VP2)衣壳蛋白；根据VP1序列的同源性，诺如病毒可分为GI～GV五个基因群(Genogroup)，其中引起人类感染的主要是GⅠ和GⅡ群

在我国及世界上大多数国家，对于食品类产品中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测缺乏标准质量控制体系，原因主要在于缺乏有效，简单、快速、可靠的技术用于浓缩和检测这些病原。实时荧光RT-PCR等分子检测方法由于其高度灵敏、特异的特点,是目前用于检测样本中食源性病毒的最有效方法，但由于果蔬产品中存在的致病病毒量极低，将极其微量但却足以使人致病的病毒粒子进行有效的浓缩，成为将这些分子方法成功应用的关键点。现行的检测方法中,缺乏对整个的检测过程进行良好质量控制的步骤和方法，本发明利用大肠杆菌噬菌体MS2与甲型肝炎病毒和诺如病毒在形态、大小、对环境的耐受力与病毒粒子相似以及对人体无危害等特性，构建了“果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒和检测方法”，准确监控病毒颗粒裂解效率和核酸提取等整个检测过程的质量控制标准体系，对食品样品和食源性病毒的监测具有重要意义，弥补了现行检测标准和方法的不足。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒和检测方法”能够监控整个检测过程并保证检测结果的有效性。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供的果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒包括HAV2×RT-PCRmix、NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、MS22×RT-PCRmix、无RNase水、HAV阳性对照、NVGⅠ+GⅡ阳性对照、大肠杆菌噬菌体MS2(2.5×10¹⁰pfu/mL)各一管。

HAV2×RT-PCRmix、NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、大肠杆菌噬菌体MS22×RT-PCRmix中涉及的检测引物和探针如下：

(1)甲型肝炎病毒检测引物和探针：

正向引物HAV-F：5’-TCACCGCCGTTYGCCTAG-3’

反向引物HAV-R：5’-GGGGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3’

探针HAV-P：5’-FAM-CCTGAACYYGCAGGAATYAA-MGB-BHQ-3’

(2)