[发明专利]一种蛋白质分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质分离领域，具体涉及一种蛋白质分离纯化的方法。

背景技术

蛋白质的分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之中分离纯化出所需目的蛋白质的方法，在生物化学研究应用中使用广泛，是当代生物产业的核心技术。

蛋白质的分离纯化既要利用不同蛋白间内在的相似性，又要利用其差异，其中，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，以及利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物中提取出来。但是，目前蛋白质的分离纯化面临的技术问题在于：其技术难度高、成本高。例如，一个生物药品的成本75％都花在下游蛋白质分离纯化当中。

在蛋白质的生物化学研究中，电泳可以根据不同的电荷差异(在没有变性的凝胶电泳中)或者蛋白质的分子量的大小(在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)将蛋白混合物分离而成为不同蛋白条带。在一维凝胶电泳中，变性凝胶电泳的主要用途是从凝胶中检测和定位蛋白质，同时也可以用来从混合物中进一步分离纯化蛋白质。一维凝胶电泳中使用最广泛的是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在典型的SDS-PAGE中，样品用还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)和高浓度的SDS(2％)进行处理。还原剂可以使由二硫键连接起来的蛋白质分解，SDS将结合到蛋白质基团上。经过这些处理，蛋白质将按照其分子量在电场中移动。同非变性凝胶电泳相比，SDS-PAGE有更高的分辨率，更重要的是提供了一个可靠的方法来判断蛋白质分子量的大小。虽然SDS-PAGE和非变性凝胶电泳已经广泛的应用于生物化学研究，但是它们有几个不同点。首先，非变性凝胶电泳分辨率比较低，从而限制了它的使用。其次，在收集活性蛋白质和研究蛋白质的催化性能的试验中，因为蛋白质都被固定到聚丙烯酰胺凝胶中，所以蛋白质在凝胶中的催化效率不如在溶液状态下高。第三，因为许多蛋白质在通常条件下是以聚合体的形式存在，所以在非变性凝胶电泳中很难评价单个蛋白质的性能。换句话说，SDS-PAGE提供了一个更好的纯化蛋白质的方法，但是如果需要观察离散的蛋白条带，电泳过程仍然仅限于部分纯化蛋白质的制备。如果从微生物、植物或动物中制备一种蛋白质，那么样品中就有成千上万种蛋白质，所以几乎不可能将如此多的蛋白质通过SDS-PAGE分离成离散的条带并纯化出来。此外，在SDS-PAGE中蛋白质样品的处理第一步通常是使蛋白质变性。样品的处理过程通常是添加高浓度的还原剂和去污剂，并在100℃下水浴5分钟。大多数蛋白质在这些条件下会变性，这样会使我们感兴趣的蛋白质的功能鉴定变的非常困难。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种蛋白质分离纯化的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种蛋白质分离纯化的方法，包括如下步骤：

S1、向待分离溶液中添加缓冲溶液和亲水性有机溶剂，搅拌均匀，形成双水相萃取体系，静置后，收集上相萃取液；

S2、将步骤S1收集的上相萃取液经蒸馏回收溶剂后过疏水层析柱，先用平衡液洗脱至无蛋白流出，再用洗脱液梯度洗脱，收集蛋白馏分；

S3、将S2收集的蛋白馏分加入CuSO₄溶液，使Cu²⁺与蛋白充分结合，得到蛋白生物样品上样液；

S4、将步骤S2得到的蛋白生物样品上样液加样至上样口，施加电压开始电泳，电泳结束后，得到凝胶胶条；

S5、将所得的凝胶胶条切下后横放于分离胶上，加入指示剂，进行电泳分离，电泳结束后，取出凝胶依次通过蛋白质洗脱板和分子半透膜分离，回收蛋白质。

其中，所述缓冲溶液包含以下组分：

55mmol/LpH为6.6的Tris-HCl，45-110mmol/LDTT(二硫苏糖醇)，1.3-2.4％SDS(m/v)(电泳级)，0.035-0.05％(m/v)溴酚蓝，17-26％(v/v)甘油。

其中，所述有机溶剂为天然来源的松节油衍生物。

其中，所述松节油衍生物为蒎烯的异构、歧化产物。

其中，所述分离胶由以下组分制备而成：

丙烯酰胺混合液11％-16％，其中，丙烯酰胺混合液中丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺质量比为17.55-23.95∶1；

尿素29-37％；3mol/lpH为8.35的三羟基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液20-25％；十二烷基硫酸钠(SDS)0.15-0.2％；过硫酸铵0.36-0.82％；