[发明专利]一种胞外高表达克氏原螯虾细胞色素C氧化酶的基因工程菌

权利要求书

1.一种高效分泌生产克氏原螯虾细胞色素C氧化酶(CytochromeCoxidase)蛋白的基 因工程菌，其特征在于，是将克氏原螯虾CytochromeCoxidase基因以pMA0911为表达载体， 以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌WB400、 WB600或WB800中的一种。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述CytochromeCoxidase基因的 序列如SEQIDNO.1所示。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是B.subtilis WB600。

4.一种构建权利要求1-3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步骤： (1)PCR扩增或化学合成CytochromeCoxidase基因序列；(2)将CytochromeCoxidase基 因与表达质粒pMA0911连接，构建重组质粒pMA0911-Cox；(3)将重组质粒pMA0911-Cox 转化枯草芽孢杆菌，筛选验证获得阳性转化子。

5.权利要求1-3任一所述基因工程菌在分泌生产CytochromeCoxidase蛋白中的应用方 法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：将重组菌用种子培养 基活化后，以5-8％接种量菌液转入装液量50％-60％的发酵罐中，通气量0.8-1.0vvm，搅拌 转速300-400r/min，pH不作控制，37℃培养；发酵培养基成分为玉米淀粉15-23g/L，蛋白 胨10-16g/L，酵母抽提物9-13g/L，硫酸铜0.15mM。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将重组菌用种子培养基活化后，以5％接 种量菌液转入装液量1.6L的3L发酵罐中，通气量1.2vvm，搅拌转速400r/min，pH不作控 制，37℃培养；发酵培养基成分为玉米淀粉20g/L，蛋白胨13g/L，酵母抽提物11g/L，硫 酸铜0.15mM。

8.一种高效分泌表达生产克氏原螯虾CytochromeCoxidase蛋白的方法，其特征在于， 以重组表达了克氏原螯虾CytochromeCoxidase基因的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产 CytochromeCoxidase蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将CytochromeCoxidase基因与表达质粒 pMA0911连接，构建重组质粒pMA0911-Cox，然后转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600，获 得重组菌；发酵培养基成分为玉米淀粉15-23g/L，蛋白胨10-16g/L，酵母抽提物9-13g/L， 硫酸铜0.15mM，于37℃通风发酵。