[发明专利]一种胞外高表达克氏原螯虾细胞色素C氧化酶的基因工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效胞外高表达克氏原螯虾细胞色素C氧化酶(CytochromeCoxidase) 的基因工程菌，属于基因工程技术领域。

背景技术

“眼柄切除诱导虾蟹类甲壳动物卵巢快速发育成熟”(简称虾蟹卵巢“眼柄切除效应”) 存在相似的分子机制，阐明分子机制具有重要科学意义和应用前景。如何实现无/弱副作用的 人工卵巢发育调控一直是经济虾蟹养殖的重要难题之一。目前人们虽已摸索出不少促虾蟹卵 巢快速成熟方法，如控温、控光、强化营养条件、激素处理等，但眼柄切除仍是不少虾蟹人 工育苗生产中促进亲虾卵巢快速成熟及产卵的最常用、最有效方法。目前在虾蟹繁殖季节， 人工切除雌性虾蟹的单侧眼柄用以促进卵巢同步发育、快速成熟，提高抱卵量，已在不少国 家较为普遍应用于多种海洋和淡水经济虾蟹(如斑节对虾、大西洋龙虾、锯缘青蟹等)的规 模化养殖中。然而，应用实践中会出现无法避免的副作用：切除眼柄后易致亲体蜕皮周期缩 短、死亡率上升、卵子质量下降等不良后果。虾蟹卵巢“眼柄切除效应”存在相似的分子机 制，深入阐明该分子机制将非常有助于发掘到新的、更合理的人工生殖调控分子靶点，从而 指导发展可替代眼柄切除、无/弱副作用的人工卵巢促熟思路和方法，对于经济虾蟹类人工养 殖业的发展具有重要价值。克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，俗称龙虾、小龙虾，隶属节 肢动物门、甲壳纲、十足目，是具较高经济价值的水产养殖品种之一，是研究虾蟹类卵巢“眼 柄切除效应”分子机制的一种非常好的代表动物。

CytochromeCoxidase是线粒体内膜上电子传递链的组成部分，参与细胞能量代谢。我们 前期的研究发现CytochromeCoxidase在克氏原螯虾眼柄切除后的中期及晚期表达水平均逐 渐提高，至卵巢发育至成熟期时(～15day)表达水平达到最高，与卵巢成熟标志物vitellogenin 动态表达模式类似，表明其在克氏原螯虾“眼柄切除效应”过程中具有重要功能。为深入探 究CytochromeCoxidase在克氏原螯虾“眼柄切除效应”诱导卵巢快速发育成熟中的作用和 调控模式，首先需要制备大量高活性的CytochromeCoxidase蛋白。我们采用生物安全级的 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)重组表达系统，构建高效胞外表达克氏原螯虾CytochromeC oxidase蛋白的基因工程菌，同时建立高产量发酵方法，为后续深入研究克氏原螯虾卵巢“眼 柄切除效应”的分子机制奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效胞外分泌表达克氏原螯虾CytochromeC oxidase蛋白的基因工程菌，是将克氏原螯虾CytochromeCoxidase基因以pMA0911为表达载 体，以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢杆菌是B.subtilisWB400、 WB600或WB800中的一种。

所述CytochromeCoxidase基因的序列如SEQIDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是B.subtilisWB600。

本发明的第二个目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，成功分泌表达了克氏原螯虾 CytochromeCoxidase蛋白，主要包括以下步骤：(1)PCR扩增或化学合成CytochromeCoxidase 基因序列，(2)将CytochromeCoxidase基因与表达质粒pMA0911(wapA)连接，构建重组质 粒pMA0911-Cox；(3)随后将pMA0911-Cox转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600，筛选验 证获得阳性转化子。

在本发明的一种实施方式中，表达质粒pMA0911自身信号肽替换为wapA信号肽。

本发明的第三个目的在于提供应用上述基因工程菌胞外分泌生产CytochromeCoxidase 蛋白的方法，主要包括以下步骤：将重组菌用种子培养基活化后，以5-8％接种量菌液转入装 液量50％-60％的发酵罐中，通气量0.8-1.0vvm，搅拌转速300-400r/min，pH不作控制，37℃ 培养；发酵培养基成分为玉米淀粉15-23g/L，蛋白胨10-16g/L，酵母抽提物9-13g/L，硫酸 铜0.15mM。