[发明专利]一种快速发现天然产物中低含量活性成分的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及天然产物中化合物提取分离领域，具体涉及一种快速发现复杂天然产物中低含量活性成分的方法。

技术背景

天然药物主要指天然来源的植物(中草药)、动物、微生物、海洋生物及其他生物的具有明确治疗作用的单一成分或多组分药物。

天然药物是现代创新药物发现的重要来源。许多天然来源的化合物已被发现具有多样且独特的生理活性，在此基础上一大批具有特殊治疗作用的药物被开发出来。天然活性物质往往具有结构新颖、活性高、不良反应少的特点，是制药工业中新药研发的重要来源，也是我国研制具有自主知识产权的创新药物的主要源泉(参见：萧伟，陈凤龙；国内外天然药物研究的发展现状和趋势，中草药，2009，11：1681-1687)。

大多数天然产物成分复杂，含量差异悬殊。生药中除了含量较高的成分以外，还含有数量众多、含量较低的成分。这些微量成分不仅在天然药物疗效的发挥中扮演重要角色，同时其结构和生物功能的多样性也为新药研发提供了有价值的信息。许多从天然产物中分离得到的微量成分具有新颖的化学结构和显著的生物学活性，可作为重要的先导化合物，有些还被直接开发成临床药物。例如，抗肿瘤药物紫杉醇和长春新碱、抗疟药物青蒿素等都是从植物中发现的微量成分。此外，随着科研的不断深入，天然产物中高含量的活性成分已越来越多地得到发现和研究，从新的天然资源如海洋生物和研究较少的微量天然产物中寻找新的活性成分是天然药物研发的重要方向之一。

然而从复杂的天然产物中发现新的微量活性成分却相当耗费时间、人力、物力却又低效。传统的对大量复杂天然产物进行提取、分离、反复柱色谱进行纯化的方法常常导致生药中的微量成分在多次柱色谱处理过程中损失，较难获得足够量的高纯度单体进行筛选。为发现更多的微量成分，通常采用加大生药投料量的方式来累积微量成分，但同时也会造成分离工作量的成倍增加和高含量成分的大量干扰，微量活性成分的发现效率依旧难以提高。另有报道将天然产物提取物采用制备型高效液相分离，按时间分段收集馏分，并将各馏分经脱溶剂处理后用于活性筛选。因天然药物成分众多且结构复杂多样，按时间自动化收集的馏分往往是包含2个以上成分的混合物，经初次活性测定后，还需要对显示有活性的馏分进一步分离纯化，制备出单体化合物，即需重复进行样品富集、分离纯化、馏分收集、溶剂去除、样品干燥、活性测试和结构鉴定等步骤来确定活性馏分中的活性成分。更重要的是，馏分中的微量成分很可能因达不到活性起效的浓度而被漏筛。因此，提高从天然产物中发现微量活性化合物的效率，缩短发现时间，降低发现成本，是天然药物活性成分研究和开发亟需解决的问题之一。

CN103487531A公开了一种适用于复杂天然产物高通量筛选的化合物库高效制备方法，该方法能够快速、精确、自动化地制备指纹图谱中各指纹峰对应的馏分，所制备样品纯度高，馏分不易含有共洗脱成分。但该方法由于未将复杂天然产物中的高、低含量成分区别对待，在基于全成分色谱指纹图谱的馏分制备过程中，当高含量成分的制备量达到活性筛选的起效浓度时，而低含量成分由于制备量较低，往往尚未达到起效浓度而难以被发现。因此该方法不能有效地解决低含量活性成分的发现难题。

本发明针对天然药物中的微量活性成分，在将全成分划分为高低含量成分的基础上，结合色谱峰敲除技术和高纯度馏分制备手段，快速、自动化、选择性地富集低含量馏分，使低含量成分达到能够进行筛选的有效浓度，从而显著提高复杂天然产物中微量活性成分发现的灵敏度、精确度及筛选效率，有利于活性成分的快速发现。

发明内容

针对天然药物中成分含量差异悬殊的情况，本发明建立了一种适合天然药物中低含量活性成分快速发现的方法。

本发明首先建立天然药物提取物的常规液相色谱分析方法，建立全成分色谱指纹图谱；然后，将提取物中各成分根据其相对含量划分为高含量成分和低含量成分，基于指纹图谱采用高分辨色谱峰馏分制备方法建立高含量成分馏分库，并对敲除高含量成分后的流出液(包含低含量成分)进行富集、浓缩，经二次高分辨色谱峰馏分制备获得低含量馏分库；采用串联质谱检测器同步获取高、低含量馏分库的质谱信息进行化合物鉴定；进而开展对高、低含量馏分的活性测试和量效关系考察，实现对天然药物中微量成分的活性评价。

该方法快速、精确、自动化程度高、操作简便、成本较低、适用性强，适用于天然产物中微量活性成分的发现。

本发明包括以下内容：

一种快速发现天然产物中低含量活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：