[发明专利]一种富硒益生菌中硒形态测定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对富硒益生菌中硒形态的测定方法，属于硒的分析测试领域。

背景技术

硒是人体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分，硒有抗氧化的作用，与人体健康息息相关，硒具有抗癌、保护心脏、抗肝坏死、防治近视和白内障、解毒、提高免疫力、延缓衰老和增强生殖功能等多种药理作用。据不完全统计，世界上有40多个国家和地区缺硒，而我国有72%的地区属于缺硒地区，因此，寻找和开发富硒产品，以保证人体摄入充足的硒，正被各国科学工作者关注。

乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌，能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名，乳酸菌具有多种功效，能促进动物生长，调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价；降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长：提高机体免疫力等。基于上述功效，乳酸菌目前被广泛应用于酸奶、饲料添加剂等各个领域。研究表明，乳酸菌对硒具有一定的富集效果，可利用硒进行营养强化，制成各种富硒乳酸菌产品，使其同时具备乳酸菌和硒的双重功效，发展前景广阔。

目前，通过液体发酵得到的富硒乳酸菌，大部分仅以总硒含量作为评价指标，而菌体内硒形态则不进行测定评价。而由于硒具有一定的毒性，有机硒比无机硒安全性更高，且更易被人体所吸收，故富含有机硒的乳酸菌才是人体所需要的。因此，有必要对富硒乳酸菌中的硒形态进行测定，弄清其硒形态的分布。目前，专门针对富硒乳酸菌中硒形态的测定方法尚未见报道，已有的硒形态测定方法主要针对植物、水产品、酵母等。“富硒大米中有机硒、蛋白硒、多糖硒或RNA硒含量测定方法”（专利申请号：201310135560.3）、微波消解-ICP-MS法直接测定海产品中有机硒、蛋白硒或多糖硒的检测方法”（专利号：ZL201210458397.1）等专利则采用对样品进行提取分离，将含硒的各组分分离后，然后利用ICP-MS上机测定各组分总硒含量，从而确定样品中的硒不同结合组分的含量。但该方法只能确定硒与何种生物大分子结合，而不能具体的得到各硒代氨基酸的种类；“一种硒的检测方法”（专利申请号：201310658482.5）介绍了利用HPLC-HG-AFS测定硒形态的方法，该方法通过测定样品中的总硒与无机硒含量，然后利用差减法得到样品有机硒的含量。该方法仅简单的利用总硒与无机硒的差值确定为有机硒含量，不仅结果不精确，而且也无法确定具体的有机硒为何种形式的硒；“从富硒酵母中提取含硒蛋白的方法”（专利申请号：201110440135.6）则介绍了一种利用pH值11~14的碱溶液对富硒酵母中含硒蛋白的提取的方法，但该法利用的强碱类溶液会对硒形态造成破坏，不利于硒形态的测定；“富硒植物材料中硒形态的测定方法”（专利申请号：201110428248.4）、“富硒食用菌中硒形态的测定方法”（专利申请号：201110428249.9）、“植物硒形态的检测方法”（专利申请号：201210215457.5）等专利介绍了植物类样品中硒形态的处理测定方法，这些方法采用对样品前处理后利用蛋白酶K和XIV进行酶解，将样品中各组分的硒温和的释放出来，然后利HPLC-HG-AFS或HPLC-ICP-MS上机测定硒形态。发明人利用上述方法对富硒益生菌进行硒形态测定后发现，形态提取率和仪器的检出率均很低，无法准确的得到富硒益生菌中硒形态分布，可能的原因是乳酸菌的属于细菌，其细胞结构与体内硒蛋白结构均与植物不同，利用测定植物硒形态的方法无法有效的对各形态的硒进行分离。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是:针对目前传统方法测定富硒益生菌时提取率不高或无法检出的问题，拟建立一种专门用于富硒益生菌中硒形态测定的方法。

本发明的富硒益生菌中硒形态测定的方法，包括如下步骤：

（1）样品的前处理：取经过研磨的富硒益生菌干样，加入缓冲液中，进行超声提取；

（2）样品破壁酶解：取步骤（1）经过前处理的样品，调节pH值至5-7，然后向其中加入溶菌酶，进行酶解；

（3）样品酶解：将步骤（2）破壁酶解后的样品的pH值调节至1.5-2.5，然后加入胃蛋白酶，进行酶解；

（4）样品分离后再酶解：将步骤（3）酶解后的样品进行离心分离，取离心后的上清液过0.22μm水系膜待测；将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，然后进行酶解；

（5）样品分离：将步骤（4）经胰蛋白酶酶解后的样品进行离心分离，取离心后的上清液过0.22μm水系膜待测；