[发明专利]一种兔抗卵转铁蛋白过敏原多克隆抗体的制备方法及其免疫分析方法

权利要求书

1.一种兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)抗体制备

免疫动物选用雄性西兰大耳白兔，月龄约3个月，体重约1.5公斤，免疫原为卵转铁蛋白，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初次免疫后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周和8周，五次免疫一周后采用股动脉取全血，具体做法是：

(1)初次免疫：免疫原与弗氏完全佐剂以1∶1的体积混合，经密封性良好的玻璃注射器乳化充分，直到免疫原与佐剂完全混匀并呈乳白色状态为止，免疫剂量为1mg/只，进行动物免疫；

(2)加强免疫：免疫原和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，进行动物免疫，免疫剂量为0.5mg/只；

(3)免疫完成时将采集到的血液先在37℃下凝固2h，然后保存于4℃冰箱中过夜，使血块收缩，上清液析出，取上清，-20℃冰箱保存备用；

2)抗体纯化

(1)将实验中所需的所有试剂超声20分钟；

(2)平衡纯化柱：首先用冲洗管路1-2h，选用的试剂为pH7.4的磷酸缓冲液，流速0.5-1.5mL/min，管路冲洗完毕后取纯化柱，并将封柱用的一部分乙醇溶液慢慢倒出，留下柱高度大约三分之一的乙醇溶液；将纯化柱与蛋白纯化仪连接好，用pH7.4的磷酸缓冲液冲洗平衡柱子，流速设定为0.5-1.5mL/min；观察程序屏幕中紫外和电导两条基线为平行线时，即可停止冲柱；

(3)上样：取0.5-1.5mL待纯化的兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体血清与磷酸缓冲液等体积稀释，流速设置为0.2-0.8mL/min，然后将混合液上柱；

(4)洗脱：出现杂蛋白峰后，继续用磷酸缓冲液冲洗柱子，至基线达到平衡后停止；用pH2.7的甘氨酸-盐酸缓冲液冲洗柱子，流速0.5-1.5mL/min，此时与ProteinA-Sepharose4B结合的免疫球蛋白被洗脱下来；

(5)收集：加入洗脱液后，当基线开始发生变化时就开始收集洗脱液，每个安道管收集管收集0.5-1.5mL液体，直至曲线不发生变化，停止收集；收集液经分光光度计280nm处读数，弃去吸光度值＜0.4的收集液，将吸光度值＞0.4的液体混匀后立即用Tris-HCl迅速调节抗体，使其pH至7.0；

(6)处理纯化柱：待抗体纯化结束后，用0.05-0.2mol/L醋酸迅速冲洗柱子1-3min，流速3-8mL/min，然后再用磷酸盐缓冲液平衡柱子，流速1-8mL/min，同时用pH试纸测定流出缓冲液的pH值，直到其显示中性为止；最后用质量浓度为20％乙醇溶液冲洗纯化柱20min，并使柱子中充满20％乙醇溶液，封存于4℃冰箱中；

(7)抗体保存：将纯化后的卵转铁蛋白抗体在4℃环境下用PBS透析三天，透析液为0.01M的PBS溶液，透析液每天换三到四次，透析后的抗体取出后与等体积的丙三醇混匀，分装后于-20℃冰箱中保存备用。

2.一种使用如权利要求1～3所述的制备方法制备的兔抗卵转铁蛋白过敏原多克隆抗体的免疫分析方法，其特征在于：包括如下步骤，

1)包被：用包被液稀释卵转铁蛋白标准溶液，将其包被于96孔聚苯乙烯的酶标板中，100μL/孔，于4℃冰箱中孵育12-16h后弃去孔中液体，PBST洗液洗板3次，每2分钟一次；

2)封闭：每孔加入200μl、0.5％脱脂乳粉作为封闭液，于37℃烘箱中封闭1h，取出弃去封闭液，PBST洗液洗板3次，每2分钟一次；

3)加样：每孔加入50μL卵转铁蛋白标准溶液，再加入50μL兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体，抗体的稀释倍数为1：10000，于37℃烘箱中竞争反应1h，取出用PBST洗液洗板4次，每2分钟一次；

4)加酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗用PBS缓冲液稀释10000倍，100μL/孔加入酶标板中，37℃烘箱反应30min，PBST洗液洗板4次，每分钟一次；

5)显色：需提前15min将底物A放于底物槽中，总共洗板5次，第四次后加入底物B，混匀；每孔中加入100μL，于37℃烘箱中显色约15-20min；

6)终止：在每孔中加50μL终止液终止反应；

7)读数：用酶标仪读取吸光度值，采用450-650nm双波长方式；

8)绘制标准曲线。

3.根据权利要求2所述的免疫分析方法，其特征在于：步骤1)中，卵转铁蛋白的包被量为0.03μg/孔。