[发明专利]一种兔抗卵转铁蛋白过敏原多克隆抗体的制备方法及其免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明属于大分子蛋白免疫技术领域；特别涉及用卵转铁蛋白免疫动物、特异性抗体的制备及免疫分析方法的建立。

背景技术

卵转铁蛋白(Ovotransferrin，OVTorGald3)是鸡蛋过敏原的主要过敏原之一，其含量约占蛋清总蛋白的12％，它是一种有铁离子相结合的糖蛋白，卵转铁蛋白在自由的形态下通常具有抗菌活性，卵转铁蛋白由两个结构域组成，分别为N域和C域，它是一条单一肽链，由686个氨基酸组成，它能够与铁离子相结合，是一种糖蛋白，每个蛋白分子中含有15个二硫键，具有抗氧化特性，目前对卵转铁蛋白的过敏性研究相对较少，卵转铁蛋白对温度的变化较为敏感，高温可使其过敏性受到严重的影响。若与铁离子，锌离子等金属结合形成复合体后就可以提高其热稳定性。

卵转铁蛋白是一种重要的转铁蛋白，背负着调节机体铁离子平衡的重要作用，可以维持机体铁的运输和代谢，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节等生物活性。是生物体需要的重要蛋白。

卵转铁蛋白运输铁是将铁离子在体内进行全面的运输，将铁离子送到需要的部位后，便于铁离子分离，血红蛋白的合成所需的铁离子便是其提供的，有研究表明卵转铁蛋白可以改善缺铁性贫血症状。

其次卵转铁蛋白还有抗菌的作用，它通过螯合细菌生长所需的铁离子来抑制细菌的繁殖；卵转铁蛋白存在抗菌多肽。对于能够引起病变的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等都能够阻碍其活性的作用，还能够对病毒起到抑制作用，如抗马立克氏病病毒、疱疹病毒等病毒，而且具有比血清转铁蛋白和乳转铁蛋白更好的效果。

还有抗氧化的作用，能够抑制自由基的产生，氧化损伤在SOD试验中，卵转铁蛋白抑制O2-的净化活性比抗坏血酸盐、血清蛋白和所知的抗氧化剂更高，卵转铁蛋白与金属离子结合后的比未结合金属离子的卵转的铁蛋白抗氧化活性更高，且清除氧自由基的能力最强是结合Cu2+的卵转铁蛋白。

免疫调节作用，卵转铁蛋白能够促进双歧杆菌的繁殖，以双歧杆菌促生长因子的作用存在，可以促进机体对营养物质的吸收，成为肌肉细胞营养的一种重要因子，可以促进细胞的生长和分化，从而增强机体的免疫力，卵转铁蛋白在体外能够调节鸡巨噬细胞和异嗜细胞、小鼠巨噬细胞和脾淋巴细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种兔抗卵转铁蛋白过敏原多克隆抗体的制备方法，和使用制得的抗体的免疫分析方法。本发明提供的技术方案是：

一种卵转铁蛋白兔多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)抗体制备

免疫动物选用雄性西兰大耳白兔，月龄约3个月，体重约1.5公斤，免疫原为卵转铁蛋白，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初次免疫后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周和8周，五次免疫一周后采用股动脉取全血，具体做法是：

(1)初次免疫：免疫原与弗氏完全佐剂以1：1的体积混合，经密封性良好的玻璃注射器乳化充分，直到免疫原与佐剂完全混匀并呈乳白色状态为止，免疫剂量为1mg/只，进行动物免疫；

(2)加强免疫：免疫原和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，进行动物免疫，免疫剂量为0.5mg/只；

(3)免疫完成时将采集到的血液先在37℃下凝固2h，然后保存于4℃冰箱中过夜，使血块收缩，上清液析出，取上清，-20℃冰箱保存备用；

2)抗体纯化

(1)将实验中所需的所有试剂超声20分钟；

(2)平衡纯化柱：首先用冲洗管路1-2h，选用的试剂为pH7.4的磷酸缓冲液，流速0.5-1.5mL/min，管路冲洗完毕后取纯化柱，并将封柱用的一部分乙醇溶液慢慢倒出，留下柱高度大约三分之一的乙醇溶液；将纯化柱与蛋白纯化仪连接好，用pH7.4的磷酸缓冲液冲洗平衡柱子，流速设定为0.5-1.5mL/min；观察程序屏幕中紫外和电导两条基线为平行线时，即可停止冲柱；

(3)上样：取0.5-1.5mL待纯化的兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体血清与磷酸缓冲液等体积稀释，流速设置为0.2-0.8mL/min，然后将混合液上柱；

(4)洗脱：出现杂蛋白峰后，继续用磷酸缓冲液冲洗柱子，至基线达到平衡后停止；用pH2.7的甘氨酸-盐酸缓冲液冲洗柱子，流速0.5-1.5mL/min，此时与ProteinA-Sepharose4B结合的免疫球蛋白被洗脱下来；