[发明专利]一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

氨基葡萄糖是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是一种重要的功能单糖，也是第一个被确认结构的氨基单糖。N-乙酰氨基葡萄糖是氨基葡萄糖的衍生物具有重要的生理功能，在保健食品和医药领域具有广泛应用，如能特异性地作用于关节软骨，有效治疗风湿性关节炎；可抑制白血病细胞K562的生长，是新型抗癌药物氯脲霉素的主要成分；可参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用等。

氨基葡萄糖和的生产方法可分为三种：甲壳素水解法、生物转化法和微生物发酵法，其中甲壳素水解是目前生产氨基葡萄糖的主要方法。甲壳素水解是利用强酸强碱将虾壳或蟹壳中的甲壳素水解，再经过过滤和脱色处理，最后蒸馏结晶得到成品。水解法存在很多缺点，如原料来源受到一定的地域和季节限制，环境污染严重，部分消费者服用后会过敏等。生物转化法是指利用微生物的甲壳素水解酶将甲壳素进行酶解得到单体氨基葡萄糖。相对于水解法，生物转化法对环境的污染较小，但由于甲壳素水解酶的价格较高，目前仅限于实验室研究阶段。虽然用含有甲壳素水解酶的微生物细胞直接进行生物转化可降低生产成本，但转化时间很长，生产强度很低。在这种背景下，近几年人们对微生物发酵法生产氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖产生了浓厚的兴趣。相对于水解法和生物转化法，微生物发酵法具有以下优点:1)发酵时间较短，生产强度较高；2)原料来源不受地域和季节限制，产品无鱼腥味；3)对环境污染小；4)产品来自微生物，消费者服用后不会出现过敏。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，是以枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS为出发菌株，将外源氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因，特别是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)克隆到表达载体pP43NMK，然后转化重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS得到。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因经优化后，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

所述枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72，并以木糖诱导启动子PxylA调控表达glmS基因。

所述枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS的构建方法参见：ModularpathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamineproduction.YanfengLiu,etal.MetabolicEngineering,23(2014)p42-52.

本发明优选是用表达载体pP43NMK表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，主要包括如下步骤：

1)构建重组质粒

将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(CeGNA1)，连接到质粒pP43NMK上，得到重组表达载体；

2)构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌

将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS，得到积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了一种应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，将37℃、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下发酵30h。

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。