[发明专利]检测葫芦科种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品制备方法及用途

说明书

本发明公开了检测葫芦科种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的样品制备方法及用途。本发明从处理种子样品入手，将葫芦科种子进行壳、仁分离处理，去除含毒量较低的种仁部分，留下含毒量较高的种壳部分作为待测样品，借助全自动样品快速研磨仪将经过处理的种子样品充分研磨，研磨充分的样品既可以通过RT‑PCR方法，也可以通过斑点酶联免疫吸附法(dot‑ELISA)快速检测大量葫芦科种子中的CGMMV。本发明适用于葫芦、黄瓜、瓢瓜、南瓜、长瓜、西瓜等常见的葫芦科种子的带毒检测。该发明检测方法灵敏度高、特异性好、耗时短、成本低，为葫芦科种子携带黄瓜绿斑驳病毒病的大规模检测及科学防控提供技术支撑，并为其他种子传植物病毒的检测提供借鉴。

技术领域

本发明所属领域为生物技术领域，涉及一种携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的葫芦科种子样品的处理，以及血清学和分子生物学检测方法及应用。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)于1935年在英国首次报道,随着葫芦科作物在各国间的交流引种日益频繁，随后欧洲的德国、芬兰、丹麦、俄罗斯、希腊等多个国家和地区相继报道出现该病毒的危害。

黄瓜绿斑驳花叶病毒是芜菁花叶病毒科(Tymoviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的成员。主要侵染葫芦科作物,可引起葫芦、黄瓜、西瓜、南瓜等叶片黄化畸形,生长缓慢,结果延时,果实大部分黄化变白并产生黑绿色水疤状的坏死斑,产量下降。CGMMV是世界上许多国家和地区葫芦科作物上的重要检疫性病毒，在一些地区已造成大田瓜类作物的毁灭性损失,严重威胁葫芦科作物安全生产。近年来,在我国一些地区出现进口源性的黄瓜绿斑驳花叶病毒,引起农业部、质检总局等相关部门的高度重视。2002年我国口岸检疫部门曾从日本引进的种苗中截获到该病毒，目前该病毒主要分布在我国的河北新乐、甘肃酒泉、北京平谷、辽宁盖州以及广西等部分地区。2006年12月21日,农业部发布788号公告,将黄瓜绿斑驳花叶病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物。

CGMMV寄主范围比较窄,自然侵染寄主主要是葫芦科作物,通过人工汁液摩擦接种可侵染蔓陀罗、苋色藜、昆诺藜、珊西烟、三生烟及矮牵牛。CGMMV是一种RNA病毒，典型的种传病毒，带毒种子是该病毒远距离传播的主要侵染源。病毒粒子附于种子的表皮和内种皮上，种植后形成初侵染源。种传寄主有黄瓜、西瓜、甜瓜和瓠瓜等，新鲜黄瓜种子传毒率为8％；西瓜种子传毒率为1％～5％，其中外表皮带毒量是内表皮或胚乳的20倍；甜瓜种传毒率为10％～52％；瓠瓜种子带毒率高达84％。此外，CGMMV也可通过病株的汁液接触、授粉和人工嫁接等方式传播。

种子带毒是黄瓜绿斑驳花叶病毒远距离传播的主要途径,一旦田间出现种子带毒的病苗,便会以此为初侵染源,通过非介体因素传播开来,造成严重损失。此外,葫芦是我国很多西瓜产区用于嫁接防治枯萎病的主要砧木,葫芦种子带毒很容易通过嫁接传染接穗西瓜苗,从而扩散到大田引起严重的后果。

建立健全的种子病毒检测方法,对种传传播为主的CGMMV快速、准确、高灵敏度的鉴定及检疫检测，加强进境葫芦科种子的检验检疫工作，以及防止该病毒的传入具有十分重要的意义，也对从源头上控制该病毒的扩散蔓延有重要指导意义。

CGMMV早期的检测方法主要依靠生物学鉴定和电镜观察，随着分子生物学的发展，该病毒的检测技术逐渐从传统的检测方法向基于核酸的检测技术发展。目前对CGMMV的检测方法有：生物学方法、电子显微镜技术、血清学技术、分子生物学技术等。其中比较常用的检测方法是血清学和分子生物学检测。

生物学鉴定方法虽然简单易行，但所需时间长，工作量大，且仅靠肉眼观察，稳定性和可信性不高。

利用电子显微镜技术可观察受侵染细胞的结构变化以及病毒粒体的大小和形态。由于电子显微技术检测需要很高的硬件要求,非专业人员难以完成，因而该方法只适合于辅助鉴定。