[发明专利]一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法

权利要求书

1.一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法，其特征在于，包括：

(1)以未经编辑的水稻植株为对照植株，以经靶向基因编辑获得的水稻植株为待测植株，分别提取待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA；

(2)根据与所述靶向基因编辑的靶位点相邻的基因组序列来设计特异性引物，以所提取的基因组DNA为DNA模板，加入所述特异性引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，所述DNA片段长度为200～500bp；

(3)PCR扩增完毕后直接进行高分辨率熔解曲线分析，以对照植株所对应的高分辨率熔解曲线为基准线，比较待测植株所对应的高分辨率熔解曲线与对照植株所对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，视为待测植株与对照植株的结果相同，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，视为待测植株与对照植株的结果不同，判定该待测植株编辑成功；

其中，

所述的靶向基因编辑是对水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑，所述水稻LOC_Os03g55240基因的序列如SEQ ID NO:1所示，其中第453～471位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列如下：

上游引物B1F：5’-GCACCGCGTCGGCCTCATGT-3’；

下游引物B1R：5’-CCTGCTTAAACTCCTGGGCTTCCAC-3’；

或者，

上游引物B2F：5’-TCACCGAGCACGACGTGACCTT-3’；

下游引物B2R：5’-CACGCTGAGGGAGACCTCGAACA-3’；

或者，

所述的靶向基因编辑是对水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑，所述水稻大斑基因LOC_Os12g16720的序列如SEQ ID NO:8所示，其中第764～785位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列如下：

上游引物T2F:5’-CGGTGGTGATCTCCAAGCC-3’；

下游引物T2R:5’-GGGAAGAAGTCGCCGATGGT-3’。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向基因编辑是对水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑时，所述PCR扩增的反应体系如下：rTaq，0.2μL；2×GCbuffer，5μL；2.5mix dNTP，1.6μL；10μM的上游引物，0.2μL；10μM的下游引物，0.2μL；10×Eva Green，1μL；50ng/μL的DNA，1μL；无菌水1.3μL；矿物油10-20μL。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向基因编辑是对水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑时，所述PCR扩增的反应体系如下：rTaq，0.2μL；2×GCbuffer，5μL；2.5mix dNTP，1.6μL；10μM的上游引物，0.2μL；10μM的下游引物，0.2μL；10×Eva Green，1μL；50ng/μL的DNA，1μL；无菌水1.3μL；矿物油10-20μL。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。

6.如权利要求1～5中任一所述的方法，其特征在于，所述DNA模板为直接提取的单株待测植株DNA，或者，所述DNA模板是摩尔比为1:1的待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA的混合。

7.如权利要求1～5中任一所述的方法，其特征在于，所述DNA片段为200～400bp。